This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol>
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R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears.">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths.">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. 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Las evaluaciones de las propiedades contráctiles de las fibras musculares esqueléticas individuales permeabilizadas se utilizan para investigar la función muscular en una amplia variedad de contextos. Los ejemplos incluyen los estudios que han evaluado los efectos del envejecimiento 12, ejercer 10,13,14, 15, vuelo espacial lesiones 2,3,16, tratamientos de drogas, enfermedad 17,18 19 y manipulación genética 20,21 en la estructura y función de la fibra. Debido a la capacidad de evaluar directamente el rendimiento contráctil de miofibrillas en su configuración nativa, esta técnica proporciona una plataforma atractiva desde el cual para formar una comprensión de la función miofibrilar ausente de los efectos de confusión potenciales que están presentes cuando la transmisión de la señal neuromuscular y la liberación de calcio inducida por excitación- están incluidos en el sistema bajo estudio. Además, las pruebas funcionales de las fibras individuales se puede utilizar para complementar los resultados de la identificación de proteínas contráctiles tales como lasobtenida a través de inmunohistoquímica o electroforesis en gel + western blot 22. Una de las funciones primarias de músculo esquelético es para generar la fuerza. En consecuencia o sF, una medida de la capacidad de generación de fuerza intrínseca de un sistema contráctil, es de gran interés para los fisiólogos musculares. Estimaciones fiables de sF o requieren medidas precisas de ambos CSA fibra y Fo. Puesto que las fibras son, en general, ni circular en sección transversal, ni uniformes en CSA largo de su longitud, el gran cuidado se deben tomar cuando se estima CSA. Para este fin, las mediciones se realizan en varios lugares a lo largo de la longitud de la fibra y, en cada lugar, desde dos perspectivas separadas por 90 °. Medidas fiables de Fo requieren atención a varios detalles que incluyen contabilidad de fuerza pasiva, ajustando la longitud del sarcómero para maximizar la superposición de filamentos gruesos y delgados, empleando una solución de activación con una concentración de calcio tresultados sombrero en la activación máxima, manteniendo la temperatura experimental deseada, y el mantenimiento de las condiciones óptimas de almacenamiento (temperatura y duración) de las fibras anteriores del día del experimento. Si bien los pasos descritos aquí describen el procedimiento para la evaluación de la fuerza isométrica máxima, con frecuencia es deseable evaluar otras cualidades funcionales importantes de las fibras musculares esqueléticas. Esto se puede lograr mediante la ampliación del protocolo experimental para incluir manipulaciones mecánicas adicionales de la fibra. Por ejemplo, la medición de la velocidad a la que la fibra se acorta en contra de una serie de diferentes cargas permite la determinación de la relación fuerza-velocidad, desde el que las relaciones de fuerza de potencia y la velocidad de potencia se pueden calcular 10,23,24. Además, la velocidad de acortamiento sin carga se puede determinar mediante el empleo de la &quot;prueba de holgura&quot; 25, que consisten en la aplicación de una serie de pasos de acortamiento de holgura inductor y measuring el tiempo requerido por la fibra para eliminar la holgura. Otro parámetro cinética que se reporta con frecuencia es k tr, la constante de velocidad para la fuerza de reurbanización tras una perturbación mecánica que separa temporalmente toda enlaces cruzados 26. Finalmente, la relación entre la concentración de calcio y la generación de fuerza activa (la &quot;relación fuerza-PCA&quot;) es a menudo de interés 18 y se puede determinar mediante la exposición de la fibra a una serie de soluciones con concentraciones de calcio que van desde por debajo del umbral para la activación del contráctil sistema para aquellos suficiente para provocar la activación máxima y por lo tanto la fuerza máxima (F o). Aunque gran parte de los equipos mencionados se necesita para evaluar la contractilidad sola fibra, otros equipos no es absolutamente necesario. El controlador longitud, por ejemplo, es esencial para cualquier protocolo experimental que requiere alargamiento o acortamiento rápida o precisa de la fibra,pero no es absolutamente necesario para la evaluación de la fuerza isométrica máxima (aunque un nivel de fuerza cero en el registro de la fuerza aún debe ser identificado por algunos medios). Los prismas que permiten la observación de la fibra desde el lado, si bien son útiles para la evaluación de área de sección transversal, no son absolutamente necesarios cuando el posicionamiento de la fibra dentro de la cámara experimental. Además, medios alternativos para la exposición de la fibra a las diversas soluciones experimentales podría ser empleado, incluyendo la elaboración de un sistema de accionamiento manual de cámaras o una cámara única que permite el llenado rápido y el vaciado de las soluciones. Finalmente, mientras que las temperaturas experimentales sub-fisiológicos tales como 15 ° C se utilizan comúnmente para mejorar la reproducibilidad de las mediciones mecánicas 1,2,3,5,8,12,17,27, es posible generar datos válidos a otras temperaturas 23 28, siempre y cuando los efectos de la temperatura sobre las propiedades de la solución (concentración de calcio, pH, etc.) se toman en consideración. </p&gt; Las composiciones de las soluciones de pruebas son algunos de los aspectos más críticos de las técnicas de fibra permeabilizadas descritos aquí. Consideraciones con respecto a composición de la solución son complejos y más allá del alcance de este artículo. Las soluciones descritas en el paso 5 de la sección de protocolo están diseñados con un énfasis en la rápida activación de la fibra permeabilizada sobre su transferencia desde la pre-activación para activar soluciones mientras se mantiene una fuerza constante iónica, composición catiónica, y la osmolaridad 6,29. Otros enfoques de la composición de la solución se han empleado con éxito notable por otros grupos de investigación y por lo general hacer uso de las constantes de unión publicados y herramientas computacionales 27,30,31. Las concentraciones de iones de calcio en las diversas soluciones de activación es particularmente importante en los estudios que implican la activación submáxima tales como evaluaciones de fuerza-PCA. Para los experimentos en los que las fibras están totalmente activadas, tales como las describird aquí, la concentración de calcio en la solución de activación normalmente supera por un margen cómodo que requiere para lograr la máxima fuerza, por lo que su conocimiento preciso menos crítica. La adición de fosfato de creatina es importante para amortiguar las fluctuaciones intramyofibrillar ATP y ADP que de otro modo estarían asociados con la actividad contráctil. Se requiere creatina quinasa para catalizar la transferencia de fosfato a partir de fosfato de creatina al ADP. Bajo condiciones experimentales que dan lugar a altas tasas de rotación de ATP, incluyendo el trabajo a altas temperaturas o medir acortamiento de alta velocidad en las fibras rápidas 32, la creatina quinasa debe ser añadido a la solución para complementar la creatina quinasa endógena que permanece unido a la fibra. Para las condiciones experimentales menos exigentes, el sistema de regeneración de ATP es menos crítico 27. Limitaciones de la técnica de una sola fibra permeabilized incluyen los siguientes. Los datos generados por estas pruebas definen elpropiedades contráctiles de la unidad miofibrilar específico que se une al aparato experimental. En consecuencia, esta captura sólo una pequeña fracción de toda la fibra multinucleadas del que se obtuvo el segmento que, a su vez, representa una pequeña fracción del número total de fibras dentro del músculo. Por tanto, los investigadores deben considerar cuidadosamente el muestreo necesario para apoyar las conclusiones extraídas de los experimentos. Además, la evaluación del impacto de una intervención práctica de ejercicio en función de la fibra presume que las fibras evaluadas fueron efectivamente reclutados durante el entrenamiento. Aunque el protocolo intenta imitar el medio intracelular natural de la fibra, el proceso de permeabilización sarcolema no es específica y necesariamente permite constituyentes intracelulares solubles para difundir libremente en las soluciones de baño. Una consecuencia adicional de la permeabilidad de la membrana es un cambio en el equilibrio osmótico se evidencia por una hinchazón en volumen de fibras 33. Loshinchazón de la fibra aumenta la distancia entre los filamentos de actina y miosina que resulta en reducción de la sensibilidad de calcio del sistema myofilament 34,35, pero puede ser revertida por la introducción de compuestos grandes, osmóticamente activos 34. Una limitación final a considerar es la consecuencia de la técnica utilizada para fijar las fibras al aparato experimental. Esto requiere invariablemente que distorsionan la relación espacial dentro del sistema de filamento en y cerca de los puntos de fijación, con la asistencia a los déficits funcionales. Específicamente, las regiones de la fibra en y adyacente a los puntos de fijación están funcionalmente comprometidas y por lo tanto contribuyen elasticidad serie de artefactos para el sistema de medición. En resumen, hemos descrito un medio por el cual para evaluar la capacidad de generación de fuerza de las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas químicamente in vitro. Aunque el foco de este artículo ha sido sobre la evaluación de la fuerza isométrica máxima generatincapacidad g de fibras de músculo esquelético humano, el enfoque experimental puede ser modificado y ampliado para determinar una variedad de parámetros cinéticos y las relaciones a través de una gama de especies de mamíferos, o de otra manera.

La función primaria del músculo esquelético es para generar la fuerza. La fuerza muscular se provoca in vivo a través de una compleja secuencia de eventos que incluye los potenciales de acción del nervio motor, la transmisión neuromuscular, los potenciales de acción de la fibra muscular, liberación de calcio intracelular, y la activación del sistema de proteínas reguladoras y contráctiles. Debido a la generación de fuerza es el resultado final de esta secuencia, un déficit en la fuerza podría ser causada por el fallo de uno o más de los pasos individuales. Un atributo clave de la preparación de la fibra permeabilizadas es que elimina la mayor parte de los pasos necesarios para la generación de la fuerza in vivo, con sólo las funciones de regulación y contráctiles asociados con el aparato miofibrilar restante. El investigador asume el control de la entrega de la activación de calcio y energía (ATP), y es recompensado con un sistema simplificado que permite la evaluación de las estructuras de regulación y contráctiles aislados en su co nativanfiguration. Las mediciones de la fuerza utilizando fibras musculares esqueléticas permeabilizadas son por lo tanto valioso al evaluar las alteraciones en la función muscular observada in vivo. Por ejemplo, hemos utilizado esta técnica para caracterizar la capacidad de generación de fuerza de fibras a partir de ratones deficientes en miostatina 1 y para evaluar la causa de la debilidad muscular persistente exhibido siguiente rotadores crónica del manguito de lágrimas 2,3. Metodología de fibra permeabilizada moderna se remonta a principios de los estudios influyentes 4,5 y está actualmente en uso por un número de grupos de investigación. Aunque las técnicas se han descrito en la literatura, que aún no se han presentado en formato de vídeo. El objetivo de este artículo es ilustrar una versión actualizada, técnica válida y fiable para medir la capacidad máxima fuerza generadora de fibras individuales de las muestras de músculo esquelético permeabilizadas químicamente. Para lograr esto, un segmento de fibra individual (denominado en este documento como un ̶0; fibra &quot;) se extrae de un paquete pre-permeabilizadas de fibras y se colocan en una cámara experimental que contiene una solución relajante, la característica que define que es una concentración de calcio que es &lt;10 nM. La fibra se adjunta a continuación, en un extremo a un transductor de fuerza y ​​en el otro extremo a un controlador longitud. Con la fibra celebrada en una longitud óptima del sarcómero, se transfiere a una solución de activación que tiene una concentración de calcio suficiente para provocar la activación máxima y así la máxima fuerza de contracción isométrica. Los datos de fuerza son adquiridos, almacenados y analizados utilizando una computadora personal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Fibras individuales Saludables, permeabilizadas químicamente deben aparecer uniforme en forma y tener un espaciado entre estrías coherente cuando se observa bajo una gran ampliación. Las fibras que son inflexibles cuando se manipula con las pinzas o tienen daños estructurales evidentes deben ser desechados. Imágenes digitales de alta magnificación tomadas durante el paso 15 se analizan para 5 mediciones de diámetro a lo largo de pares de la sección media de la fibra. Fibra CSA se estima suponiendo una sección transversal elíptica y un promedio de 5 mediciones individuales CSA como se representa en la figura 7A. La Figura 7B también sirve para ilustrar cómo dimensiones de las fibras en una sola vista puede ser significativamente diferente en comparación con las dimensiones pareadas en la otra vista (es decir, transversal secciones no son, en general, redonda). Rastros de fuerza representativos de fibras lentas y rápidas humanos se muestran en las Figuras 8A y 8B, respectivamente. Voltagsalida e de la fuerza-transductor se adquiere durante una prueba y se convierte en la fuerza (mN) usando adquisición de datos y el software de análisis (LabVIEW). La Figura 9 ilustra el enfoque utilizado para evaluar la fuerza activa máxima (F o), que se calcula restando la fuerza requerida para mantener la fibra en longitud óptima del sarcómero mientras que en un estado relajado (fuerza pasiva, F P), de la mayor fuerza isométrica desarrollado durante la activación de fibra máxima (fuerza total, F T). Desde la salida de la fuerza-transductor que corresponde a fuerza cero es, en general, diferente para cada una de las diferentes cámaras de baño, que aflojamos brevemente la fibra, tanto en la pre-activación y la activación de soluciones para capturar el nivel de fuerza cero en el registro experimental. La normalización de la fuerza activa máxima por la fibra CSA se utiliza para generar el valor más informativo de la fuerza específica (SF o). Debido a que toma en consideración el CSA de la fibra, SF o </sub&gt; proporciona una medida de la capacidad de generación de la fuerza intrínseca del aparato contráctil de la fibra, lo que permite comparaciones funcionales entre las fibras de tamaños dispares. Debe, sin embargo, cabe señalar que las mediciones de CSA no son capaces de distinguir la proporción de la fibra ocupada por filamentos contráctiles frente a la proporción ocupada por otras estructuras subcelulares. Las características típicas de salud, fibras adultos de Claflin et al. 2011 10 para el consumo humano, Mendias et al. 2011 1 de ratón y Gumucio et al. 2012 2 de rata se detallan en la Tabla 3. Todos los datos que se presentan en la Tabla 3 fueron generados utilizando el técnicas descritas en este artículo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humano (Vasto externo) </strong&gt; </td><td> Ratón (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rata (Infraespinoso) </td></tr><tr><td colspan="2"> Masculino </td><td colspan="2"> Femenino </td><td> Masculino </td><td> Masculino </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (No escrito) </td><td> (No escrito) </td></tr><tr><td> CSA (m 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> Fo (mN) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64 a 0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14 hasta 0,25 </td><td> 0,55 hasta 0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Características típicas de fibras adultos sanos de vasto lateralis humana 10, extensor largo de los dedos del ratón y la rata infraespinoso 1 2 músculos. Longitudes óptimas sarcómero se fijó en 2,7 micras para las fibras humanas 7,8 y 2,5 micras, tanto para ratón (36, 37) y fibras de rata (38). Rangos Experimental L F (25 º y 75 º cuartiles) fueron 1,39 a 1,73 mm, 1,17 a 1,53 mm y 1,32 a 1,59 mm para humanos, ratones y ratas, respectivamente. Los rangos mostrados indican los 25 º y 75 º cuartiles y n es el número de fibras probadas. Los problemas más comunes experimentados durante las pruebas incluyen una hoja de lazo de sutura, lo cual resulta en una fuerza response con una &quot;captura&quot; tal como el ilustrado en la Figura 10A, y una lágrima de espesor parcial o total de la fibra, lo que resulta en una respuesta de fuerza que vuelve bruscamente hacia o para (rotura) de cero mientras que la fibra está todavía inmerso en la activación de solución (Figura 10B). Si un resbalón, desgarro o ruptura se produce durante un experimento, la fibra debe ser desechada y los datos excluidos, aunque se mantiene un registro de los fallos en fibra también puede ser informativo 11. Otro resultado negativo que se puede encontrar es la activación prematura de la fibra, mientras que en la solución (Figura 10C) pre-activación. Activación parcial en la solución de pre-activación sugiere la contaminación cruzada así significativo (es decir, un aumento no intencional en la concentración de calcio en la pre-activación de bien). En este caso, todos los baños deben ser aspiradas y se enjuagan bien con agua desionizada. El secado de las superficies divisorias entre las cámaras también es recomended como la humedad o condensación en estas áreas puede conducir a la mecha de la solución entre baños. La decisión de incluir o excluir datos en última instancia, dependerá del enfoque experimental y por lo tanto deben ser considerados en el diseño del estudio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: bucle de sutura (10-0 sutura con monofilamento de nylon). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Disección Bundle fórceps están en la mano izquierda, tijeras de microdisección están en la mano derecha. La línea roja indica la orientación favorable de la muñeca y tijeras con los ejes longitudinales de las fibras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) un aparato de pruebas con componentes etiquetados. (A) cámaras experimentales con fondos transparentes. (B) Longitud-controlador. (C) Fuerza-transductor. (D) Fuente de luz. (E) Longitud-controlador de la unidad micrómetro xyz con pantalla digital. (F) Unidad Etapa micrómetro con pantalla digital. (G) Fuerza-transductor unidad micrómetro xyz. (H) Plataforma de calibrado pantalla de destino láser de difracción. Mesa de aislamiento (i) de la vibración. (B) Vista de primer plano de las cámaras experimentales. Superficie (j) de fijación de acero inoxidable que se extiende desde el controlador de longitud. Superficie (k) de fijación de acero inoxidable se extiende desde el transductor de fuerza. (L) Vista lateral del prisma. (M) de Vivienda para los módulos de refrigeración termoeléctricos. (N) Termopar para reportar te cámaramperatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificado 100 punta de la pipeta l utilizado para transferir la fibra de plato de la disección de cámara experimental. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montaje sola fibra en aparato experimental (A) bucles de sutura preparados rosca sobre superficies de fijación de acero inoxidable. (B) Fibra transferido a la cámara experimental. (C) de la fibra anclado a las superficies de fijación de acero inoxidable por primera par de bucles de sutura con el exceso de sutura eliminado. (D) Segundo par de bucles de sutura roscados sobre la parte superior de la primera bucles de sutura y atados en su lugar. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: la longitud del sarcómero se evalúa mediante la proyección de un patrón de interferencia de láser sobre una pantalla de destino calibrado (a) fuente láser.. (B) Espejo. (C) la pantalla de destino. Patrón de interferencia (d) láser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (A) Determinación de la zona de la fibra de la sección transversal a la longitud óptima del sarcómero (humanos = 2,7 micras). Suponiendo una sección transversal elíptica, CSA se calcula para cada uno de los cinco lugares a lo largo de la sección media de la fibra y la media de las cinco mediciones individuales se informa como fibra CSA. 2a representa la parte superior de diámetro y es vista<html> uno de los ejes de la elipse, 2b representa la vista lateral de diámetro y es el otro eje de la elipse. (B) Las imágenes de fibra representativos que ilustran cada una de las cinco medidas del diámetro correspondientes tomadas tanto en la vista superior y lateral. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: rastros de fuerza representativas de vasto humano sano lateralis fibras musculares (A) Tipo 1 fibra (CSA: 5.710 m 2, H o: 0,89 mN y SF o: 156 kPa).. (B) Tipo de fibra 2a (CSA: 9.510 m 2, Fo: 1,66 mN y SF o: 174 kPa). Miosina de fibra Tipo de cadena pesada se determinó mediante el uso de técnicas de separación electroforética y tinción con plata 22. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Cálculo de la fuerza activa máxima (F o) (a) Vista ampliada de la respuesta de la fuerza de la fibra durante el movimiento holgura inductores de longitud controlador iniciado en solución pre-activación.. F P es la fuerza requerida para mantener una longitud del sarcómero de 2,7 micras con la fibra en reposo. (B) Vista Ampliada de longitud-controlador de movimiento holgura inductores. Tenga en cuenta que F o = F T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: deslizamiento (A) de bucle de sutura, lo demuestra un &quot;retén&quot; en vigor rastro durante el aumento de la fuerza. Revise para asegurarse de que los bucles son seguras antes de activar la fibra. (B) ruptura de la fibra durante la activación. Puede ser debido a una mala integridad de la fibra o el tratamiento de fibra agresivo durante cabo lazo de suturación. (C) la activación de fibra parcial prematura debido a la contaminación de la cámara de pre-activación con Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Análisis de las propiedades contráctiles de las fibras musculares, esqueléticas químicamente piel o permeabilizadas ofrece un poderoso medio de la cual evaluar la función muscular a nivel de la célula muscular individual. En este artículo describimos una técnica válida y fiable para preparar y probar permeabilized fibras musculares esqueléticas in vitro.

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K vistas.  University of Michigan Medical School.  Análisis de las propiedades contráctiles de las fibras musculares, esqueléticas químicamente piel o permeabilizadas ofrece un poderoso medio de la cual evaluar la función muscular a nivel de la célula muscular individual. En este artículo describimos una técnica válida y fiable para preparar y probar permeabilized fibras musculares esqueléticas in vitro. 

Video: Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

La medición de la cohesión agregado por tensiometría tejido de la superficie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Investigación

Bioingeniería

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparación de Membranas Light responden por un injerto superficial combinado y proceso de modificación posterior

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.