Este protocolo muestra una guía paso a paso para medir la rigidez de hidrogeles y células utilizando un nanopenetrador disponible comercialmente y también presenta un software de código abierto para analizar de forma reproducible los datos adquiridos. Sin embargo, el protocolo nos permite obtener datos similares a la microscopía de fuerza atómica a una fracción de la complejidad. Por lo tanto, este protocolo será útil para los científicos interesados en estudiar las propiedades mecánicas de muestras sanas y enfermas, pero también creemos que será de mayor aplicabilidad en el contexto de la nanoindentación para materiales blandos.
Después de encender el instrumento y montar la sonda seleccionada para el experimento, comience a calibrar la sonda. Haga clic en Inicializar en la ventana principal del software. En el menú Calibración que aparece, introduzca los detalles de la sonda en los cuadros de entrada.
A continuación, llene una placa de Petri gruesa de vidrio con un fondo plano con el mismo medio que el plato de muestra, y haga coincidir la temperatura del medio con la de la muestra. Luego, coloque el plato de calibración debajo de la sonda. Para la calibración en líquido, humedezca previamente la sonda con una gota de etanol al 70% o isopropanol con el extremo de la pipeta en contacto ligero con la virola de vidrio, de modo que la gota se deslice sobre el voladizo y la punta esférica.
Luego, deslice manualmente el brazo del nanoindentador hacia abajo hasta que la sonda esté completamente sumergida pero aún lejos del fondo de la placa de Petri. Espere cinco minutos para permitir que se alcancen las condiciones de equilibrio en el líquido. A continuación, en el menú Inicializar del software, haga clic en Longitud de onda de escaneo.
La pantalla del interferómetro mostrará una barra de progreso. Compruebe si el escaneo óptico se realizó correctamente navegando hasta el panel Escaneo de longitud de onda en la caja del interferómetro. A continuación, en el menú Inicializar, haga clic en Buscar superficie para bajar progresivamente la sonda.
La sonda deja de moverse cuando entra en contacto con la placa de Petri de vidrio. Una vez que la sonda esté en contacto con la superficie, mueva la sonda hacia abajo un micrómetro usando el botón de flecha y hacia abajo en la ventana principal del software. Observe la señal verde en la ventana en vivo para detectar cambios en la línea de base con cada paso de un micrómetro.
A continuación, haga clic en Calibrar en el menú Inicializar. Cuando se complete la calibración, compruebe los factores de calibración antiguos y nuevos en la ventana emergente que se muestra. Si el nuevo factor de calibración está en el rango correcto, como se explica en el manuscrito, haga clic en Usar nuevo factor.
A continuación, sube el piezo 500 micrómetros. A continuación, compruebe si el círculo de demodulación se ha calibrado correctamente navegando a la pestaña Demodulación en el escritorio del interferómetro. Golpee suavemente la mesa óptica o el nanopenetrador para inducir suficiente ruido.
Un círculo blanco de puntos de datos discretos debe cubrir aproximadamente el círculo rojo. Cargue la placa de Petri que contiene la muestra en la etapa del microscopio y mueva manualmente la sonda del nanoindentador a la posición deseada sobre la muestra. Deslice la sonda en solución, teniendo cuidado de dejar uno o dos milímetros entre la sonda y la superficie de la muestra.
Espere cinco minutos para que la sonda se equilibre en solución. Concéntrese en la sonda con el microscopio óptico. Para medir el módulo de Young de materiales blandos, haga clic en Configurar experimento.
Agregue un paso Buscar superficie y una sola sangría en el control de desplazamiento para determinar los parámetros experimentales que se utilizarán posteriormente para el escaneo automático de matrices. Si la sangría única se realiza correctamente, configure una exploración matricial que contenga de 50 a 100 puntos espaciados de 10 a 100 micrómetros. Después de asegurarse de que la casilla Encontrar superficie automática esté marcada, haga clic en Usar posición de etapa para iniciar el escaneo de matriz desde la posición de etapa actual.
Configure el perfil de escaneo de matriz en el control de desplazamiento. Deje el número de segmentos en cinco y utilice el perfil de desplazamiento predeterminado. Si es necesario, cambie el perfil de desplazamiento y el tiempo para cada segmento inclinado.
No exceda las tasas de deformación superiores a 10 micrómetros por segundo. Guarde el experimento configurado en la ruta de acceso del experimento deseada. Haga clic en Ejecutar experimento y espere a que se complete.
Cuando se adquieran todos los datos, limpie la sonda y apague el instrumento como se describe en el texto. Para la detección de curvas de desplazamiento de fuerza y la producción de conjuntos de datos limpios en formato JSON, inicie prepare. py desde la línea de comandos en el equipo del laboratorio.
Seleccione el formato de datos Optics11 de la lista desplegable. Si los datos no se cargan correctamente, vuelva a iniciar la interfaz gráfica de usuario y seleccione Optics11 Old. Luego, haga clic en Cargar carpeta y seleccione una carpeta que contenga los datos a analizar.
Limpie el conjunto de datos utilizando las pestañas presentes a la derecha de la interfaz gráfica de usuario. Luego, haga clic en Guardar JSON e ingrese un nombre apropiado para el conjunto de datos limpiado. Envíe el archivo JSON a la computadora donde se instaló el software NanoAnalysis, si es diferente de la computadora actual.
Lanza el nano. py desde la línea de comandos. En la parte superior izquierda de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en Cargar experimento y seleccione el archivo JSON.
Esto rellenará la lista de archivos y el gráfico de curvas sin procesar que muestra el conjunto de datos en términos de curvas de desplazamiento de fuerza. En el cuadro Estadísticas, compruebe los valores de los tres parámetros, N activado, N fallido y N excluido. Para visualizar una curva específica con más detalle, haga clic en la curva.
Esto lo resaltará en verde y lo mostrará en el gráfico de curva actual. Una vez que se ha seleccionado una sola curva, los parámetros R y k se rellenarán en el cuadro Estadísticas. Una vez que el conjunto de datos se haya limpiado aún más, filtre cualquier ruido en las curvas utilizando los filtros implementados en el cuadro Filtrado.
A continuación, inspeccione las curvas filtradas en el gráfico de curvas actual. La curva filtrada está en negro, mientras que la versión no filtrada es verde. Para encontrar el punto de contacto, en el cuadro Punto de contacto, elija uno de una serie de procedimientos numéricos que se han implementado en el software.
Ajuste los parámetros del algoritmo para adaptarse al conjunto de datos para que el punto de contacto se ubique correctamente, como se explica en el manuscrito. Para ver dónde se ha encontrado el punto de contacto en una sola curva, seleccione la curva haciendo clic en ella. A continuación, haga clic en Inspeccionar.
Compruebe la ventana emergente que aparece para identificar dónde se ha ubicado el punto de contacto. A continuación, haga clic en Análisis de hercios. Esto generará tres gráficos.
Compruebe los datos de sangría de fuerza para cada curva en el conjunto de datos, junto con el ajuste promedio de Hertz que se muestra en rojo. A continuación, compruebe la curva de indentación de fuerza media con una banda de error que muestre una desviación estándar, junto con el ajuste medio de Hertz que se muestra en rojo. A continuación, verifique el diagrama de dispersión del módulo de Young que se origina al ajustar el modelo de Hertz a cada curva individual.
Inspeccione el cuadro Resultados para el módulo de Young medio calculado y su desviación estándar, y asegúrese de que sean razonables para el experimento dado. Luego, en el cuadro Guardar, haga clic en Hertz. En la ventana emergente, ingrese el nombre del archivo y el directorio, y haga clic en Guardar.
Se creará un archivo tsv. Abra el archivo tsv en cualquier software adicional para el análisis estadístico y el trazado posterior. Para obtener datos de nanoindentación celular, haga clic en Análisis de espectros de elasticidad.
Inspeccione las dos gráficas producidas, a saber, el módulo de Young en función de la profundidad de sangría para cada curva y el módulo de Young promedio en función de la sangría ajustada por un modelo bicapa. Una vez finalizado el análisis, haga clic en ES en el cuadro Guardar. Esto exportará un archivo tsv en el directorio especificado, que se puede abrir y trazar en cualquier otro software de su elección.
Un experimento exitoso da como resultado el segmento de aproximación de una curva de desplazamiento de fuerza, que tiene una línea de base clara y plana, una región de transición y una región inclinada. Las curvas que muestran alteraciones de esta forma se eliminan fácilmente del conjunto de datos utilizando NanoPrepare. Aquí se muestran las curvas de fuerza-indentación promedio junto con el modelo de Hertz promedio para un hidrogel de poliacrilamida blanda y un hidrogel rígido.
Al trazar los valores individuales del módulo de Young, se recuperó el módulo de Young promedio esperado para ambos hidrogeles. Para los experimentos de nanoindentación celular, la curva de fuerza-indentación promedio y el modelo de Hertz promedio correspondiente demuestran que el modelo de Hertz no captura completamente la evolución de la fuerza con el aumento de la profundidad de indentación para los experimentos de nanoindentación celular. Aquí se demuestran los espectros de elasticidad promedio ajustados hasta una hendidura de 200 nanómetros.
Los espectros de elasticidad promedio comienzan a aumentar a una profundidad de indentación de 200 nanómetros, lo que indica la contribución de un sustrato al módulo de Young aparente sondeado. Debido a esto, se eligió 200 nanómetros como el rango de ajuste tanto para el modelo Hertz como para el modelo bicapa. El ajuste del modelo bicapa permite extraer más información sobre el estado mecánico de la célula, incluido el grosor de la corteza de actina celular, el módulo de la corteza de actina celular y el módulo de masa celular, como se explica en el texto principal.
Una comparación directa entre el modelo de Hertz y el enfoque de espectros de elasticidad en términos de la distribución del módulo de Young revela distribuciones superpuestas con medias comparables, lo que demuestra la viabilidad del enfoque de espectros de elasticidad. Localizar con precisión el punto de contacto y mantener los parámetros del algoritmo elegidos consistentes entre los conjuntos de datos que se desean comparar es primordial para obtener comparaciones confiables entre muestras. El método es de aplicabilidad general para cuantificar las propiedades elásticas locales de muestras biológicas, incluyendo esferoides, organoides, tejidos y, en general, toda la materia blanda.
