우리의 방법의 중요성은 질문에 대답하는 능력에있다, 구역 섬유의 점탄성 특성은 무엇인가, 눈 내부의 렌즈를 중단 섬유? 우리의 기술의 주요 장점은 표적 유전자 수정의 유무에 관계없이 마우스에서 작고 섬세한 구역 섬유의 점성 탄성을 정량화 할 수 있다는 것입니다. 마이크로피브릴 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 여러 가지 상속된 신디로믹 조건의 기초가 됩니다.
우리의 기술을 사용하여, 우리는 특정 돌연변이가 마이크로 피브릴스의 생물역학적 특성을 어떻게 변화시키는지 조사할 수 있습니다. 시작하려면 마우스를 안락사 후 미세 한 포셉을 사용하여 눈을 제거합니다. 눈벽을 통해 고정 바늘의 끝을 삽입하고 렌즈를 손상시키지 않도록 주의하여 유리체 유머의 중앙에 배치하십시오.
4%파라포름알데히드와 인산염 완충식식염으로 채워진 튜브에 찔려 눈을 조심스럽게 옮겨. 고정 기간 동안 눈 내의 수은 15~20밀리미터에 해당하는 양압을 유지하고 밤새 수정하도록 샘플을 남겨두는 시료 보다 25센티미터 높은 고정 된 저수지에 바늘을 연결하는 밸브를 엽니 다. 다음 날, 고정 바늘을 제거하고 인산염 완충 식염수로 10 분 동안 눈을 씻으시다.
안과 외과 가위와 스테레오 현미경을 사용하여 시신경 헤드 근처의 눈 벽에 전체 두께 절개를합니다. 절단을 적도쪽으로 앞으로 확장한 다음 눈의 적도 둘레 를 중심으로 조심스럽게 섬세한 섬광 공정과 관련 구역 섬유를 절약합니다. 전 세계 뒷면을 제거하여 렌즈의 후방 표면을 노출합니다.
집게를 사용하여 버퍼 용액에서 해부된 눈을 제거하고 각막이 아래쪽으로 향하여 건조한 작업 닦아냅니다. 각막을 닦은 표면 위로 부드럽게 드래그하여 건조시합니다. 50mm 페트리 접시 의 바닥에 인스턴트 접착제 한 방울을 바르고 플랫폼을 수정합니다.
접착제와 잘 볼 수 있도록 스테레오 현미경의 무대 접시에 접시를 배치합니다. 페트리 접시의 플랫폼 우물에서 눈을 수용할 수 있도록 인스턴트 접착제 3마이크로리터를 추가합니다. 조심스럽게 우물에 넣고 렌즈 뒷면이 위쪽으로 향할 수 있도록 빠르게 조정합니다.
마른 닦아의 모서리를 부드럽게 블로팅하여 렌즈의 노출된 면을 건조시다. 구역 점탄성 반응을 측정하려면 스케일을 켜고 Petri 접시를 스케일에 배치한 다음 스케일 로깅 프로그램 및 카메라 소프트웨어를 시작합니다. 서보모터 컨트롤러를 켭다.
컴퓨터에서 컨트롤러 응용 프로그램을 시작하고 50 마이크로미터 단위로 모션 매개 변수를 설정합니다. 모세관 막대에서 90도 굽힘을 만듭니다. 구부러진 모세관을 모세관 프로브 홀더에 넣고 고정 나사를 조입니다.
모세관 팁에 작은 UV 경화 접착제를 추가합니다. 조작기의 수동 조정을 사용하여 모세관 프로브의 끝을 이동하고 렌즈 의 상단에 직접 배치합니다. 현미경 카메라를 사용하여 전면 육안 검사 및 측면 보기를 통해 UV 접착제의 바닥 부분이 렌즈 의 상단을 중심으로 나타나는지 검사합니다.
카메라를 들여다보는 동안 UV 접착제가 렌즈와 접촉하고 상부 표면의 1/3에서 1/2를 덮을 때까지 프로브 팁을 낮춥춥습니다. 380~400나노미터 파장의 방향에 가까운 UV 광원을 사용하여 접착제를 치료하고 약 1밀리와트의 강도를 갖는다. 눈이 적어도 2 밀리미터의 깊이로 덮여 때까지 페트리 접시에 PBS 솔루션을 추가합니다.
현미경 앞에 원통형 렌즈를 놓고 페트리 접시에 닿지 않고 가깝게 놓습니다. 동시에 타이머 프로그램에서 로깅을 시작합니다. 카메라를 사용하여 눈과 프로브의 사진을 찍습니다.
60초 후에 50마이크로미터 변위를 시작합니다. 모든 구역 섬유의 파손에 의해 표시된 대로 실험이 완료될 때까지 60초마다 반복합니다. 실행이 완료되면 스케일 로깅 데이터를 저장하고 호환되는 스프레드시트 형식으로 내보냅니다.
또한, 실행 중에 얻은 렌즈 사진을 저장합니다. 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다. 첫 번째 및 마지막 축척 판독값을 사용하여 증발로 인해 시간이 지남에 따라 백그라운드 판독에서 드리프트를 보간한 다음 각 시간 지점에서 판독값에서 보간 배경을 뺍니다.
증발을 위한 분석 및 수정을 수행한 후 점탄성 데이터의 그래프가 반전됩니다. 순간적이고 편안한 힘의 크기는 각 단계별로 약 1, 000초까지 증가한 다음, 모든 섬유가 파손될 때 1, 500초 시점까지 구역 섬유가 파손되기 시작하면 떨어집니다. 이러한 데모를 위해, 야생형 및 MAGP-1 결핍 마우스에 대한 점탄성 반응도 비교하였다.
0~600초의 초기 시점에서 그래프는 서로 유사하여 구역 섬유의 점탄성 특성이 크게 변경되지 않음을 시사합니다. 그러나 MAGP-1 녹아웃 마우스에서는 섬유가 조기에 분해됩니다. 종광섬유 파괴력은 1개월 및 1년 된 단계에서 매그P-1 대 야생형 마우스에 대한 풀업 방법으로 수득되었다.
결과는 야생 형 마우스에 대한 나이에 따라 섬유의 강도가 증가한다는 것을 나타냈다. 이러한 단계 동안 Petri 접시와 우발적으로 접촉하면 눈 벽이 눈 렌즈에 비해 이동하여 구역 섬유가 손상될 수 있습니다. 이 풀업 분석체는 마이크로피브릴의 인장 강도에 기여하는 단백질을 식별하는 데 도움이 됩니다.
이 정보를 사용하여 구역 섬유 내부의 보다 사실적인 모델을 구축할 것입니다.
