Así que mi laboratorio está interesado en entender cómo el ojo y el cerebro crecen juntos. Esta técnica nos permite estudiar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del cerebro. La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo, seguida de la observación del tectum óptico, nos permite comparar lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales.
La combinación de esta técnica con enfoques moleculares modernos puede dar una nueva visión de los mecanismos subyacentes al desarrollo neuronal, la regeneración y la degeneración. Para comenzar, conecte los cables de cátodo y ánodo a la fuente de alimentación. Coloque el clip de cocodrilo en el extremo del alambre del cátodo a un clip parcialmente enderezado e inserte el clip en la solución de hidróxido de potasio, uniéndolo al costado del frasco.
Conecte el clip de cocodrilo del alambre del ánodo al cuello del soporte de la aguja. Gire la potencia a aproximadamente 20 voltios y sumerja el cable de tungsteno en la solución de hidróxido de potasio, sacando el cable de la solución en ángulo para afilar electrolíticamente el cable en una punta fina. Revise la punta de la aguja debajo del microscopio de disección para asegurarse de que sea lo suficientemente afilada.
La punta de la aguja curva se produce cuando la aguja afilada se dobla tocándola suavemente en la placa de Petri. El día de la cirugía, use una pipeta de pasto de vidrio de diámetro ancho para transferir de 10 a 15 larvas a una placa de Petri de 35 milímetros llena de E3 fresco. Agregue de tres a cinco gotas de anestésico a la larva. Para determinar si las larvas están adecuadamente anestesiadas, busque la falta de respuesta táctil.
Agregue dos o tres gotas más del anestésico si las larvas aún responden al tacto después de tres minutos y vuelva a evaluar. Para inmovilizar la larva para la cirugía, lleve una larva a una pipeta de pasto de vidrio de diámetro estrecho con solo una pequeña cantidad de E3. A continuación, tome aproximadamente 200 microlitros de punto de fusión fundido al 1% bajo o agarosa LMP en la pipeta que contiene la larva y mezcle para asegurarse de que la larva esté suspendida en la agarosa LMP. Coloque la tapa de una placa de Petri de 35 milímetros boca arriba bajo el microscopio de disección, luego rocíe la larva y la agarosa sobre la tapa de la placa de Petri al revés.
Extienda la agarosa para que la larva esté en el centro de la gota. Usando una aguja de tungsteno opaca, maniobre rápida pero suavemente la larva para que quede lateral con un ojo hacia arriba. Espere varios minutos para que la agarosa se establezca.
Siguiendo el borde de la órbita del ojo, use la punta de una aguja de tungsteno fina y afilada electrolíticamente para perforar la piel alrededor del ojo. Luego deslice el borde de la aguja debajo del ojo desde el lado temporal-ventral del ojo. Use presión controlada para liberar el ojo de la cuenca.
Siga presionando el ojo dorsal y anteriormente con el lado de la aguja, eventualmente cortando a través del nervio óptico y liberando el ojo. Alternativamente, puede usar fórceps quirúrgicos muy finos para extirpar el ojo pellizcando el nervio óptico y empujando el ojo de medial a lateral. Después de la extracción exitosa del ojo, cubra la agarosa con solución MMR, libere a cada larva de la agarosa cepillando suavemente una aguja de tungsteno alrededor de su cabeza y luego alrededor de su cuerpo, mientras estabiliza la tapa de la placa de Petri con fórceps.
Después de las cirugías, coloque la larva en una solución MMR suplementada con antibióticos hasta el día siguiente, luego devuelva la larva al E3 y recuévala hasta el punto final del experimento. Después de que las larvas se anestesian terminalmente, fíjelas con paraformaldehído al 4%. Suspenda las larvas fijas en gotas de PBS en una placa de protección de sellos bajo un microscopio de disección.
Asegúrelos lateralmente colocando dos pasadores de tungsteno a través de la notocorda con un pasador posterior al área pigmentada que cubre la región AGM y otro en línea con el extremo de la extensión de la yema. Retire el ojo con una aguja de tungsteno afilada y fórceps finos. A veces es posible pasar la aguja a través de la mandíbula hasta el lado opuesto y extraer el otro ojo.
Use la aguja de tungsteno para rascarse desde el lado temporal hasta el ventral de la oreja. En la misma acción en movimiento, lleve la aguja hacia atrás de la mandíbula y tire suavemente hacia arriba hasta que se retiren la oreja y la mandíbula. Extraiga el otro ojo y la oreja metiendo la aguja a través de la mandíbula.
Use fórceps para extraer los órganos ventrales y la yema restante. Finalmente, haga una incisión poco profunda en la piel craneal dorsal cerca de la unión entre el cerebro posterior y la médula espinal. Levante la piel con las pinzas y tire de ella hacia arriba y alrededor del telencéfalo.
Retire cualquier tejido restante con fórceps. Desancle la larva y transfiérala a PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Asegure un portaobjetos con cámara en la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros con grasa al vacío.
Transfiera la larva inmunoteñida y procesada a una placa de pozo o portaobjetos de depresión para verlas con un microscopio de disección. Monte la larva en el portaobjetos con cámara en columnas de agarosa 1%LMP. Usando un vaso más allá de su pipeta, coloque una larva en el portaobjetos con cámara, depositando la menor cantidad de PBS posible.
Cubra la larva con agarosa 1%LMP derretida y tibia con la misma pipeta. Pipetear la agarosa LMP en una columna y luego colocar la larva lo más simétricamente posible con la superficie dorsal visible. Después de la extirpación ocular, se observó degeneración progresiva de los axones de la retina en el tectum neuropil óptico.
A los dos días después de la cirugía, los axones etiquetados con RFP exhibieron características distintivas de la rápida degeneración walleriana, como balbuceos y fragmentación. Se observaron puncta positivos de RFP tanto dentro como fuera del neuropil en el lado derecho del tectum como lo indican las flechas. A los cuatro días después de la cirugía, los axones fragmentados y los restos axonales marcados con RFP se redujeron considerablemente en el lóbulo tecttal derecho, lo que indica una eliminación relativamente rápida de los axones moribundos y degenerativos.
El cerebro fue expuesto diseccionando los ojos, la mandíbula, las orejas y la escutelaria de la piel y los tejidos conectivos. Idealmente, el cerebro permanece intacto durante este procedimiento. Sin embargo, partes del cerebro anterior, particularmente el bulbo olfativo, probablemente se dañaron o se eliminaron por completo cuando se eliminó la tapa del cráneo de la piel o la mandíbula.
Además, a veces la cornisa lateral del tectum se corta al perforar o pellizcar la piel para sacarla del cerebro. No hay dos muestras idénticas. Por lo tanto, debe poder hacer adaptaciones sutiles a través de la extirpación de los ojos y la disección cerebral según sea necesario.
Los pacientes y las herramientas afiladas son esenciales para el éxito. Esta técnica puede ser seguida con enfoques celulares y moleculares, como imágenes de células vivas in vivo o secuenciación de ARN para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares y celulares del crecimiento y desarrollo del tectum óptico.
