Nuestra comprensión de la morfogénesis ocular proviene de estudios previos de tejidos fijos. Sin embargo, estos estudios carecían de dinámica celular y tisular. Usando imágenes de lapso de tiempo, podemos capturar todo este proceso para visualización y análisis.
Nuestro método que aprovecha el desarrollo externo en la claridad óptica de los embriones de pez cebra, que facilitan la obtención de imágenes en vivo, y utiliza la microscopía confocal de barrido láser que está fácilmente disponible en la mayoría de los campus de investigación. Los investigadores nuevos en este método deben esperar algo de prueba y error antes de obtener un conjunto de datos utilizable. Muchos pasos, especialmente las inyecciones y la incrustación, deben ir bien para tener éxito, así que ten paciencia.
Una vez que el pez cebra comienza a reproducirse, mientras espera de 15 a 20 minutos para asegurarse de que los huevos se fertilizen, use una pipeta P10 y puntas de microlitro P10 para cargar una aguja de microinyección capilar de vidrio tirado con 2.5 a 5 microlitros de la dilución de ARN de interés. Cuando los óvulos estén listos, use una pipeta de transferencia y un microscopio de disección para cargar cuidadosamente los huevos en el molde de inyección, usando forrceps para enrollar los embriones de tal manera que la célula única sea visible según sea necesario. Luego inyecte todos los embriones en la etapa de una célula, dirigiéndose a la célula y no a la yema para garantizar un etiquetado uniforme del embrión en desarrollo.
Aproximadamente a las 11 horas después de la fertilización, coloque una alícuota de uno a cinco mililitros de agarosa de fusión baja al 1.6% en medio E3 en un bloque de calor de 42 grados Celsius y use un microscopio de fluorescencia para detectar embriones inyectados con éxito con un brillo general de florescencia. Cuente los somitas para estadificar adecuadamente los embriones. A las 11 horas después de la fertilización, se deben observar tres somitas.
Una muestra ideal tendrá fuertes señales EGFP y mCherry y estará en la etapa de desarrollo correcta. Antes de montar, coloque los embriones en un plato recubierto de agar y use forrórceps para extraer el corion de cada embrión. Cuando todos los embriones hayan sido despojados, use una pipeta de rodillo de vidrio para aspirar un embrión.
Expulse la mayor cantidad posible de E3 para que el embrión se asiente en la punta de la pipeta de pasteur de vidrio y deje caer el embrión en el tubo de agarosa del bloque de calor. Deje que los embriones se hundan en la agarosa durante unos segundos antes de aspirar un pequeño volumen de agarosa junto con el embrión, cuidando que el embrión permanezca en la punta de la pipeta. Expulse el embrión y la agarosa en una gota de agarosa en un plato con fondo de vidrio y use fórceps rápida pero cuidadosamente para orientar el lado dorsal del embrión hacia abajo antes de que la gota de agarosa se endurezca.
Después de montar de 10 a 12 embriones de la misma manera, agregue suficiente agarosa para cubrir completamente la parte inferior del plato encerrando todas las gotas en un solo disco de agarosa. Cuando la agarosa se haya endurecido, coloque la capa E3 sobre la agarosa para mantener las muestras hidratadas. Después de configurar el microscopio confocal de escaneo láser a los parámetros apropiados para las imágenes de lapso de tiempo, cubra generosamente la parte inferior del plato con fondo de vidrio con un medio de inmersión que coincida con el índice de refracción del agua, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire y aplique una pequeña gota de medio de inmersión al objetivo de agua 40X.
Asegure el plato con fondo de vidrio en el inserto de la etapa y agregue un medio E3 adicional para mantener los embriones húmedos durante la noche. Use arcilla de modelado para sellar la tapa de plástico sobre el plato y elevar el objetivo para hacer contacto con el plato. En el encabezado de posiciones del software del microscopio, haga clic en agregar para guardar la información XYZ de la primera muestra que se caducará y seleccione una muestra con una fluorescencia fuerte y un montaje óptimo.
En la pestaña Localizar, busque la siguiente muestra y haga clic en posición y agregar para seleccionar la muestra como se muestra. Cuando se hayan seleccionado todas las muestras, resalte la primera posición y haga clic en Mover a. Mientras escanea continuamente, alinee la vesícula óptica dentro del marco, dejando un amplio espacio en las regiones anterior y distal en relación con la vesícula óptica y el cerebro.
Para asignar la primera y la última rebanada Z, seleccione establecer primero y establecer último mientras se mueve a través de la dirección Z con la perilla de enfoque fino, manteniendo un número total de cortes de aproximadamente 63 para acomodar el crecimiento de la copa óptica. Incluya espacio adicional en el lado ventral de la vesícula óptica para permitir espacio para el crecimiento. Una vez que se hayan configurado la primera y la última rebanada Z, haga clic en C para desplazarse al centro de la pila Z y ajustar la potencia y la ganancia del láser para ambos láseres.
Cuando se hayan establecido la potencia y la ganancia del láser, detenga el escaneo y haga clic en actualizar para actualizar la información de posición. Para pasar a la siguiente posición, haga clic en la posición dos. Una vez que se hayan definido tanto la primera como la última división Z como demostradas, abra el encabezado de la serie temporal y establezca el número de ciclos en 300 y el intervalo de tiempo en 2,5 minutos.
Después de revisar la configuración para asegurarse de que todo esté finalizado, haga clic en iniciar para comenzar el lapso de tiempo y confirme que la primera ronda de imágenes se captura correctamente antes de permitir que el lapso de tiempo se ejecute durante la noche. La inyección directa en la célula individual es necesaria para un etiquetado uniforme y una fluorescencia robusta. Tras su inmersión en agarosa, los embriones deben espaciarse uniformemente a lo largo del plato.
Si los embriones están estadificado correctamente, lo suficientemente fluorescentes y montados adecuadamente, permanecerán en el marco de la imagen durante el lapso de tiempo, lo que permitirá obtener imágenes de todo el órgano. Las muestras que no están orientadas a lo largo del eje dorsal, como las que son horizontales o diagonales, crecerán fuera del marco de la imagen a medida que avance el lapso de tiempo y no se pueden usar para análisis posteriores. Un embrión que está sobre-rotado dará como resultado un lapso de tiempo más posterior.
Un embrión que está sub-rotado permitirá que sólo se observe la mayor cantidad de tejido anterior. Además, las muestras que se montan con respecto a la orientación del marco tienen más probabilidades de producir un lapso de tiempo exitoso. Este sesgo hacia el lado ventral proporciona espacio adicional para el crecimiento del tejido en la dirección ventral, lo que resulta en un lapso de tiempo óptimo.
Cuando no se cumplen estos criterios, el lapso de tiempo ya no capturará todo el volumen 3D del tejido a medida que se desarrolla y no se puede utilizar para un análisis posterior. Estos conjuntos de datos ricos en información se pueden analizar de muchas maneras, incluido el seguimiento celular 4D con cuantificaciones de velocidad y trayectoria celular, mediciones de volumen celular y tisular, y visualizaciones 3 y 4D.
