KPM fue apoyada por la UE del 7 º PM (RETICIRC).

1. La cría de peces Los embriones se mantienen y se crió en condiciones normales (Marca 2002) y por etapas de acuerdo al desarrollo de la fertilización días después (DPF). Adultos y larvas en 5 fdd fueron utilizados para las mediciones. 2. Procedimiento experimental <ol><li> Preparación de instrumentos </li></ol> Larvas: Las larvas fueron incorporados en el 3% de pre-calentado (28 ° C) metilcelulosa para evitar los movimientos del cuerpo. Los embriones fueron colocados lado dorsal en el VisioTracker, frente a la pantalla de proyección. Los peces adultos: Los peces fueron anestesiados brevemente en 300 mg / l MS-222, equipado en el dispositivo de inmovilización y se coloca en el VisioTracker. Antes de que se iniciaron las mediciones, se quedaron para recuperarse durante 1-2 min. <ol start="2"><li> Generación de patrones de estímulos </li></ol> Patrones de estímulos consiste en vertical, negro y blanco de onda senoidal rejillas girando alrededor de los peces fueron creados con el paquete de software propietario. Que puede ser modulada a través del paquete de software de acuerdo a la forma de onda, frecuencia de contraste, la intensidad, la velocidad angular y espacial. Los patrones fueron proyectadas sobre la pantalla con un proyector de luz digital contenida en el VisioTracker. La distancia aproximada entre el ojo del pez y la pantalla fue de 4,5 cm y tamaño de la proyección en pantalla era de 360 ​​grados en horizontal y 55 º verticalmente. Para larvas de peces, la dirección de la estimulación se alteró con una frecuencia de 0,33 Hz para reducir la frecuencia sacada. Los peces adultos fueron estimulados unidireccional y sólo el ojo estimulado en lo temporal a la dirección nasal se consideró, ya que nasal a temporal la velocidad del ojo en general es mucho menor y menos constante (se refieren a Mueller y Neuhauß, 2010). <ol start="3"><li> Grabación de los movimientos oculares </li></ol> Una imagen de campo claro de la cabeza del pez se alimenta a una cámara de video infrarroja. Iluminación de infrarrojos de los peces se llevó a cabo desde abajo. La cámara de imágenes grabadas a una velocidad de 5 fotogramas / segundo (larvas) o 12,5 cuadros / segundo (adultos), respectivamente. Las imágenes se procesan automáticamente, corregida y suavizada por la forma del ojo. La orientación del ojo en relación con el eje horizontal se determina automáticamente la velocidad del ojo y se calculó por el paquete de software propietario. Pequeños movimientos de los peces se han corregido de forma automática por el software. Todos los registros y análisis se logró en tiempo real. 3. Post-procesamiento de datos experimentales <ol><li> Mediciones brutas de las velocidades de los ojos fueron filtradas para sacadas con el fin de extraer lenta velocidad de fase. </li><li> Sacada con filtro de curvas de velocidad ojos se suavizaron por un promedio de ejecución con una ventana deslizante de 7 cuadros. </li><li> La velocidad promedio de atención fue sobre los marcos de las condiciones de estímulos idénticos. </li><li> Para larvas de peces, la velocidad del ojo fue un promedio de más de dos ojos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Con el fin de evaluar las capacidades de la VisioTracker de peces en estado larvario y adulto, se realizaron experimentos con larvas de pez cebra a 5 dpf, y adultos de pez cebra. Para larvas de pez cebra, el mutante parachoques fue elegido. En este objetivo mutante, las células epiteliales hyperproliferate, lo que reduce el tamaño del objetivo y localización ectópica de la lente. Estas alteraciones morfológicas se reflejan en una reducción significativa de la sensibilidad al contraste y la agudeza visual (Schonthaler et al., 2010). La Figura 1 muestra la diferencia en la sensibilidad al contraste de los mutantes de parachoques frente a los hermanos de tipo salvaje. Mutantes parachoques cada vez menos para ajustar la velocidad del ojo a medida que disminuye el estímulo de contraste. Por analogía, cuando la frecuencia del estímulo espacial es mayor, es decir, el ancho de banda de estímulo se reduce, los mutantes parachoques también demuestran la agudeza visual reducida (Fig. 2) La dependencia de los adultos de pez cebra rendimiento visual de las condiciones ambientales fue investigado por someter a los peces a diferentes concentraciones de alcohol en el tanque de agua durante 30 minutos y, posteriormente, para medir la respuesta optocinético en condiciones diferentes estímulos. Adultos de pez cebra muestran una marcada reducción en la sensibilidad al contraste cuando se mantiene en la concentración de alcohol en aumento (Fig. 3). Un dependiente de la dosis similares de reducción de la velocidad total del ojo en un amplio rango de frecuencias espaciales se pudo observar que los peces fueron tratados con concentraciones de alcohol en aumento (Fig. 4). Tratamiento de alcohol, además, dependiendo de la dosis reduce el rendimiento oculomotor en tareas más exigentes como lo demuestra una velocidad mayor estímulo (Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig1.jpg" /> Figura 1. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la diferencia de estímulo. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje se analizaron en 5 fdd en diversas stimulus condiciones banda de contraste. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig2.jpg" /> Figura 2. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la frecuencia espacial. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje fueron sometidos a diferentes anchos de banda de estímulo a las 5 fdd y analizados como se describe. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig3.jpg" /> Figura 3. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración en la reducción de la sensibilidad al contraste. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de contraste de estímulo de banda. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg" /> Figura 4. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de ancho de banda de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y analizada bajo diferentes condiciones de ancho de banda de estímulo. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig5.jpg" /> Figura 5. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de velocidades de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de estímulo de velocidad. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11).

<ol>
	<li>Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fade+out+mutant+is+a+novel+genetic+model+for+Hermansky-Pudlak+syndrome.">The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome.</a> Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).</li><li>Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrumentation+for+measuring+oculomotor+performance+and+plasticity+in+larval+organisms.">Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms.</a> Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).</li><li>Brand, M. G. M., N&#252;sslein-Vollhard, C., N&#252;sslein-Vollhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+Zebrafish.">Keeping and raising Zebrafish.</a> Zebrafish, Practical Approach Series. , 7-37 (2002).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+vision+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of vision in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+eye+movements+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in zebrafish: behavior and histology.</a> Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).</li><li>Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optokinetic+response+in+zebrafish+and+its+applications.">The optokinetic response in zebrafish and its applications.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).</li><li>Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+tuning+by+visual+feedback+of+the+stability+of+a+neural+integrator.">Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish.">Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).</li><li>Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+asymmetries+in+the+optokinetic+response+of+larval+zebrafish.">Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish.</a> Zebrafish. 2, 189-196 (2005).</li><li>Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+arrestin+confers+cone+vision+of+high+temporal+resolution+in+zebrafish+larvae.">Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).</li><li>Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optokinetic+behavior+is+reversed+in+achiasmatic+mutant+zebrafish+larvae.">Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae.</a> Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).</li><li>Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+sensitivity,+spatial+and+temporal+tuning+of+the+larval+zebrafish+optokinetic+response.">Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 .</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone+specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone-response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Roeser, T., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visuomotor+behaviors+in+larval+zebrafish+after+GFP-guided+laser+ablation+of+the+optic+tectum.">Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum.</a> J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).</li><li>Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+leberkn+del/vam6+resembles+human+multi-systemic+disorders+caused+by+aberrant+trafficking+of+endosomal+vesicles.">The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles.</a> Development. 135, 387-399 (2008).</li><li>Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+bumper+shows+a+hyperproliferation+of+lens+epithelial+cells+and+fibre+cell+degeneration+leading+to+functional+blindness.">The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness.</a> Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).</li><li>Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. v. o. n., Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+pmel17+gene+leads+to+defects+in+melanosome+biogenesis+and+alterations+the+visual+system+in+the+zebrafish+mutant+fading+vision.">A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision.</a> Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).</li></ol>

Oliver DR Schnaedelbach y Holger D. Russig son empleados del TSE Systems GmbH que produce el sistema de seguimiento del rendimiento visual utilizados en este artículo. La producción de este artículo fue patrocinado por TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass es un empleado de la Universidad de Zurich, que recibe una remuneración por los sistemas de TSE para cada sistema vendido.

La importancia de la okr para el estudio de la función visual ha sido reconocido en la comunidad científica desde hace mucho tiempo (Semana Santa y Nicola 1996, 1997), y los intentos de cuantificar realmente el paradigma de haber comenzado más de una década atrás. Semana Santa y Nicola (1996) desarrolló un sistema motorizado con tambores rotativos de rayas, donde se analizó la grabación de vídeo de movimiento de los ojos de forma manual. Este sistema sufrió de la falta de inmovilización de los embriones de pez, que requiere reposición manual frecuente, y puede detectar los movimientos de seguimiento de los ojos sólo con gran dificultad. Un paso adelante fue el uso de un tambor rayado video-proyectado para permitir una mayor presentación de estímulos variables generadas por ordenador (Roeser y Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a). La mayor parte manual, cuadro a cuadro el análisis de grabaciones en vídeo ha demostrado ser extremadamente difícil, y hasta cierto punto, obstaculizado por el sesgo del observador (Beck et al., 2004). El análisis automatizado en tiempo real, se sugirió que se permita el uso de mecanismos de retroalimentación del comportamiento de aprendizaje (al Mayor et al., 2004). El uso de la iluminación infrarroja y la frecuencia de los estímulos controlados de rotación ha sido promovida por Beck et al. (2004). Sin embargo, el sistema descrito no sólo se ha utilizado para las larvas, y el análisis se llevó a cabo fuera de línea. Además, el VisioTracker permite un control completo sobre los estímulos, incluyendo el cambio de los estímulos durante el experimento, lo que permite una mayor flexibilidad y la influencia espontánea en el transcurso del experimento. Además, la creación de estímulo digital utilizado por el VisioTracker superó los problemas mencionados anteriormente con la aceleración de la masa inerte de un tambor de estímulo a rayas (Beck et al., 2004). Restricción de las larvas de metilcelulosa no interfiere significativamente con el movimiento del ojo y no tiene ningún efecto a largo plazo sobre el bienestar del pez cebra. Las larvas de peces se han mantenido con éxito incrustado en metilcelulosa durante varios días, hasta el suministro de oxígeno a través de la piel se vuelve insuficiente para la demanda que aumenta la edad (Qian et al., 2005). El método de restricción de peces adultos es igual de fácil en el animal. La corta duración del experimento, junto con la opción de intercambiar rápidamente el animal de experimentación para uno diferente, se suma a los aspectos de bienestar de los animales positivos del sistema. Desde las branquias están continuamente bañadas por el agua, es conveniente pico el agua con cualquier producto químico de elección para estudiar su efecto sobre los movimientos de los ojos y el rendimiento visual. Del mismo modo un experimento de lavado se puede añadir sin la necesidad de manejar el animal entre los experimentos. Ruido de los píxeles de la imagen de vídeo se ha minimizado por los algoritmos de suavizado del software VisioTracker de propiedad, lo que permite mediciones de alta precisión de la posición del ojo y la velocidad angular. Además, para facilitar el análisis estadístico, el software filtra los movimientos sacádicos que se producen a una velocidad fija y que no contribuyen a la declaración experimental. El promedio de curvas de velocidad de más de 7 fotogramas de vídeo facilitado su posterior análisis. El VisioTracker abre una nueva dimensión para muchos campos de investigación variados. El sistema y sus predecesores ya han sido utilizados con éxito para cuantificar el rendimiento visual en larvas de pez cebra, utilizando parámetros como la agudeza visual, sensibilidad al contraste y la adaptación a la luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), para el análisis funcional de conos siguientes manipulación de los miembros de la cascada de transducción visual (por ejemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o el análisis de los defectos visuales en las larvas de pez cebra mutante (por ejemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). La interdependencia de la maduración morfológica y funcional del sistema visual ha sido estudiado por las mediciones okr para mostrar que la agudeza visual es todo, pero no completamente limitado por espacio de fotorreceptores en la etapa larval (Haug et al., 2010). El VisioTracker es adecuado para analizar la función visual en adultos de pez cebra y otras especies de peces de tamaño parecido (Mueller y Neuhauß (2010), este informe). También es concebible utilizar el sistema en áreas de investigación tales como la toxicología o farmacología que las sustancias a investigar podrían añadirse al flujo de agua alrededor de las branquias de peces adultos. Además, la versatilidad de VisioTracker permite realizar análisis más a fondo, por ejemplo, de ontogenetics de la función visual, la función de circuitos neuronales y el desarrollo, o sensitivomotora de control (véase la revisión de Huang y Neuhauß, 2008).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> El 3-aminobenzoato metanosulfonato (MS-222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> 35 mm placa de cultivo celular </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Suero de la pipeta </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612 361 </td></tr><tr><td> VisioTracker </td><td> TSE Sistemas </td><td> 302060 </td></tr></tbody></table>

visiotracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis

Las investigaciones sobre el desarrollo del sistema visual y la función necesario cuantificar los modelos de comportamiento de los resultados visuales que son fáciles de obtener, robusto y fácil de manipular. Un modelo adecuado se ha encontrado en la respuesta optocinético (okr), un comportamiento reflexivo presente en todos los vertebrados, debido a su valor de alta selección. El okr implica lento siguientes estímulos movimientos de ojos rápidos alternados con movimientos sacádicos reposición. La medición de este comportamiento es fácil de llevar a cabo en las larvas de pez cebra, debido a su aparición temprana y estable (completamente desarrollado después de 96 horas después de la fecundación (HPF)), y se benefician de los conocimientos a fondo sobre el pez cebra genética, desde hace décadas uno de los modelos favorecidos organismos en este campo. Mientras tanto, el análisis de mecanismos similares en peces adultos ha adquirido mayor importancia, particularmente para aplicaciones farmacológicas y toxicológicas. A continuación se describe VisioTracker, un sistema totalmente automatizado, de alto rendimiento del sistema de análisis cuantitativos de rendimiento visual. El sistema se basa en investigaciones llevadas a cabo en el grupo del Prof. Stephan Neuhauß y fue re-diseñado por Sistemas de EET. Se trata de un dispositivo de inmovilización para los peces pequeños controlados por una cámara de vídeo de alta calidad, equipado con una lente de zoom de alta resolución. El contenedor de pescado está rodeado por una pantalla de tambor, en el que los patrones generados por computadora estímulo puede ser proyectada. Los movimientos del ojo se registran y analizan de forma automática por el paquete de software VisioTracker en tiempo real. El análisis de datos permite el reconocimiento inmediato de parámetros tales como la duración de la fase lenta y rápida, la frecuencia del ciclo de movimiento, el aumento lento de la fase, la agudeza visual y la sensibilidad al contraste. Los resultados típicos permiten, por ejemplo, la rápida identificación de los mutantes del sistema visual que no muestran ninguna alteración evidente en la morfología de tipo salvaje, o la determinación de los efectos cuantitativos de agentes farmacológicos o tóxicos y mutagénicos en el rendimiento del sistema visual.

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VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

visiotracker-an-innovative-automated-approach-to-oculomotor-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K vistas.  University of Zurich. El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la inte...

Video: VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Investigación

Neurociencias

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

VisualEyes: Un sistema de software modular para experimentación oculomotor

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

El análisis automatizado de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamiento de la nadada El uso de software Célest

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análisis de la marcha automática en ratones con lesión de la constricción crónica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.