RNAi는 선충류에서 유전자의 기능을 확인하는 효과적인 방법이되었으며 병원성 선충류를 효과적으로 제어하는 새로운 방법으로 제안되었습니다. RNAi는 선충류를 dsRNA에 담그고 시술에 충분할 수 있다. 시작하려면 Baermann 깔때기 방법으로 선충류를 수집하십시오.
이를 위해 깔때기 아래에 고정 된 고무 튜브를 놓고 깔때기 입구에 두 겹의 여과지를 놓습니다. Botrytis cinerea 곰팡이 배양 물을 깔때기로 옮기고 물을 추가하여 곰팡이 매트를 담그십시오. 선충류가 수집되면 500 마이크로 리터의 추출 시약과 100 마이크로 리터의 자성 비드를 2 밀리리터 원심 분리 튜브에 첨가합니다.
20 마이크로 리터의 선충류를 흡인하고 샘플을 9, 000 x g에서 30 초 동안 분쇄합니다. 5 분 동안 배양하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
100 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하십시오. 3 분 동안 배양 한 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. 다시, 상청액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
250 마이크로 리터의 이소 프로필 알코올을 첨가하고 격렬하게 소용돌이칩니다. 12, 000 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 와류. 상청액을 버리고 500 마이크로 리터의 75 % 에탄올을 첨가하여 RNA를 세척합니다.
샘플을 와동시킨 후 섭씨 4도에서 5 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. RNA 펠릿을 5분 동안 자연 건조시키고 30마이크로리터의 RNase 자유수에 재현탁시킵니다. 이 공식을 사용하여 RNA 농도를 계산하고 A260 대 A280 비율을 계산합니다.
다음으로, 프라이머 쌍을 사용하여 B.xylophilus로부터 BX ppm-1 유전자의 부분 코딩 서열을 증폭한다. 그 다음 ppm-1 유전자 서열을 T7 프로모터를 포함하는 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝한다. 클로닝된 플라스미드를 PCR을 위한 주형으로 사용하여 894 염기쌍의 긴 ppm-1 유전자 단편을 회수한다.
그 후, 시험관내 전사 키트를 사용하여 dsRNA를 합성한다. 분광 광도계를 사용하여 dsRNA의 품질을 분석하고 1%아가로스 겔에서 제품을 시각화합니다. 4 마이크로 리터의 5X 담금 버퍼를 추가하고 이중 증류수로 부피를 20 마이크로 리터로 구성하여 밀리리터 당 0.8 마이크로 그램의 최종 RNA 농도를 얻습니다.
그런 다음 선충류를 접시에 30 분 동안 넣고 계란이 바닥에 달라 붙을 때까지 기다리십시오. 계란만 접시에 남을 때까지 계란을 방해하지 않고 물과 선충류를 조심스럽게 제거하십시오. 수집 된 알을 섭씨 25도의 어둠 속에서 24시간 동안 부화시켜 J2 유충을 얻습니다.
유충을 튜브에 모으고 이중 증류수로 3 번 씻으십시오. 그런 다음 유충을 dsRNA 용액이 들어있는 튜브로 옮깁니다. 여기에 레조르시놀 용액을 추가하여 1% 용액을 얻습니다.
유충에 dsRNA가 충분히 흡수되도록 유충을 흔들어 놓습니다. 대조군의 경우, 동일한 양의 선충류를 dsRNA 프로브 없이 또는 GFP dsRNA 프로브를 사용하여 담근 완충액에 담근다. 유전자 발현 수준의 변화를 평가하기 위해 actB 및 tbb-2 유전자를 내부 참조로 사용하여 qPCR을 수행한다.
델타 델타 Ct 방법을 사용하여 용해 곡선 및 Ct 값으로부터 상대적인 유전자 발현 수준을 추정합니다. RNAi 후, J2 유충을 PDA 플레이트의 보트리티스 시네레아 잔디밭에서 성체가 될 때까지 배양한다. 섹션 1에 표시된 대로 Baermann 깔때기 방법을 사용하여 성체를 수집합니다.
현미경으로 성충류의 이미지를 획득하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 50마리의 수컷 선충과 50마리의 암컷 선충의 몸 길이를 측정합니다. 각 표본에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석합니다. 스튜던트 t 검정을 적용하여 여러 그룹의 표본 평균을 비교합니다.
RNAi 후 상대적인 유전자 발현 분석은 ppm-1 dsRNA가 B.Xylophilus 유전자의 ppm-1 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내었다. 반면 외인성 GFP dsRNA는 ppm-1 발현에 영향을 미치지 않았다. RNAi 후, 성인의 크기는 성적 성숙에 도달했음에도 불구하고 현저하게 감소하여 작은 신체 크기의 돌연변이 표현형을 초래했습니다.
돌연변이 암컷과 수컷의 평균 몸 길이는 대조군의 971 및 912 마이크로 미터에 비해 544 및 526 마이크로 미터였습니다 가장 중요한 것은 선충류를 이중 가닥 RNA 용액으로 옮기고 다른 시약을 추가하여 선충류를 자극하여 먹이는 것입니다. 이 방법은 대규모 유전자 스크리닝에 적합하며 일반적으로 세포 연구에 사용됩니다. 이 방법으로 B.Xylophilus의 유전자 기능을 연구하는 것은 B.Xylophilus의 생물학적 제어에 대한 지침 가치가 있습니다.
