El pez cebra es único en su capacidad intrínseca para regenerar muchos tipos de tejidos diferentes, incluido el EPR. Este protocolo se puede utilizar para identificar las vías moleculares que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE. La versatilidad es una ventaja principal de esta metodología.
Además de estudiar la regeneración de RPE, este protocolo se puede utilizar para examinar los procesos degenerativos de RPE y los efectos del daño de RPE en los tejidos adyacentes en el ojo. Los mamíferos, incluidos los humanos, no pueden reparar grandes lesiones por EPR como resultado de traumatismos o enfermedades degenerativas. El uso del pez cebra como herramienta para descubrir los factores pro-regenerativos del EPR es un paso significativo hacia la promoción de la regeneración del EPR en mamíferos.
Para preparar una solución fresca de MTZ de 10 milimolares, cinco días después de la fertilización, agregue polvo de MTZ al agua del sistema sin PTU y mezcle bien agitando vigorosamente durante una hora a 37 grados centígrados. Enfríe la solución MTZ de 10 milimolares durante una hora a temperatura ambiente en un rotador o agitador de mesa. Para detectar larvas de pez cebra del transgén rpe65a:nsfB-eGFP, separe las larvas transgénicas eGFP positivas de las larvas negativas eGFP no transgénicas utilizando un microscopio estéreo fluorescente con un láser de excitación de 488 nanómetros.
Wake criabilizó las larvas inmediatamente pipeteando directamente en una placa de Petri con PTU fresca de 1.5X sin tricaína. Al finalizar el cribado, separe aún más las larvas positivas de eGFP en dos grupos de placas de Petri, un grupo para recibir tratamiento MTZ y un grupo para ser el control no abierto. Luego abole el epitelio pigmentario de la retina eliminando 1.5X PTU de los platos de tratamiento ablacionados y agregue la solución MTZ de 10 milimolares recién hecha.
También elimine 1.5X PTU de los platos de control no abiertos y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Retire la solución MTZ de 10 milimolares después de exactamente 24 horas y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Cambie el agua fresca del sistema sin PTU en los platos negativos MTZ.
Criba larvas eGFP positivas en cuatro días después de la fertilización. La eGFP es visible cuatro días después de la fertilización, pero parece más tenue que la intensidad de la señal en el quinto día. Coloque las larvas positivas de eGFP en placas de seis pocillos en lugar de placas de Petri a una densidad de no más de 10 larvas por pozo para el tratamiento farmacológico.
Designe placas separadas de seis pocillos para larvas ablacionadas y no ablacionadas. Determine el volumen de 15 micromolares IWR-1 o el volumen emparejado de los pretratamientos de control de vehículos DMSO necesarios y alícuota 1.5X PTU en tubos cónicos en consecuencia. Agregue el stock IWR-1 a 1.5X PTU para una concentración final de 15 micromolares IWR-1.
Agregue un volumen coincidente de stock DMSO a 1.5X PTU. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos. Retire 1.5X PTU de las larvas positivas de eGFP en placas de seis pocillos y agregue cinco mililitros por pocillo de tratamientos recién hechos con DMSO 0.06% o 15 micromolares IWR-1.
Ablate el RPE al día siguiente. En cinco días después de la fertilización, determine el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios para las placas de seis pocillos no ablacionadas y ablacionadas y alícuota los volúmenes apropiados de agua fresca del sistema sin PTU o solución de MTZ de 10 milimolares en tubos cónicos. Agregue soluciones de stock IWR-1 y DMSO a los tubos cónicos respectivos como se realizó anteriormente.
Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos. Elimine los pretratamientos 0.06% DMSO y 15 micromolares IWR-1 en 1.5X PTU de placas designadas de seis pocillos no abraminadas y ablacionadas. Reponga con el agua fresca adecuada del sistema sin tratamientos de solución PTU y MTZ.
Retire los tratamientos 0.06% DMSO y 15 micromolares IWR-1 en solución MTZ de 10 milimolares después de exactamente 24 horas y reponga con tratamientos en agua dulce del sistema sin PTU. Reponga 0.06% DMSO y 15 tratamientos micromolares IWR-1 en agua dulce del sistema sin PTU en la placa de seis pocillos no ablacionada. Monitoree el éxito y el alcance de la ablación in vivo utilizando la iluminación de luz transmitida en un microscopio estereoscópico para el mantenimiento larvario después de la ablación genética.
Para generar la región RPE de interés o ROI utilizando Fiji, abra una imagen TIFF de ocho bits, reoriente la imagen para que el lado dorsal esté hacia arriba y el distal se deje eligiendo imagen, transforme y voltee horizontalmente. Para el último comando, elija la opción que mejor se adapte a la direccionalidad necesaria para esa imagen. Inicie el administrador de ROI eligiendo análisis, herramientas, administrador de ROI.
Utilice la imagen, el zoom y alternar entre los canales DAPI y Brightfield. Utilice métodos abreviados de teclado para mayor eficiencia. Identifique el punto en el que el lado apical del RPE está adyacente desde la punta de la membrana limitante externa y utilice este punto de referencia anatómico como punto de partida del ROI.
Cree el ROI de RPE con la herramienta de selección de polígonos en la barra de herramientas de Fiji utilizando los canales de imagen DAPI y Brightfield y la función de zoom de imagen para identificar los límites de RPE apicales y basales. Lleve los extremos dorsal y ventral del ROI a un punto agudo en lugar de embotar o redondear. Agregue el ROI haciendo clic en agregar en el administrador de ROI.
Guarde el archivo roi eligiendo más y guarde dentro del administrador de ROI. Haga doble clic en el rpegen. m para abrir en el panel del editor.
En la sección de variable definida por el usuario del rpegen. m, ingrese las ubicaciones del directorio para las carpetas que contienen los archivos roi, los archivos de imagen tiff y dónde se deben guardar los archivos de salida. Introduzca el nombre del grupo para el archivo mat que se va a exportar y la ubicación del canal Brightfield en la pila de imágenes TIFF.
Ejecute el script haciendo clic en el botón Ejecutar en el menú del editor en la parte superior de MATLAB. Después de guardar el archivo MAT, aparecerá una figura de tres paneles y también se guardará como PDF en el directorio de salida para cada ejecución de imagen. Espere hasta que estos pdf de control de calidad se hayan guardado en la carpeta de salida y la última cifra haya desaparecido.
Abra los pdf individuales y compruebe que todos los ROI coincidan con las imágenes de Brightfield. Haga doble clic en el rpegen_permplot. m para abrir en una nueva pestaña del editor.
En la sección Variables definidas por un usuario, escriba la ubicación del directorio de la carpeta de salida que contiene los archivos MAT de la ejecución del rpegen. m script. Introduzca cada nombre de archivo MAT que se va a cargar.
Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón ejecutar sección en el menú del editor. En la sección dos, introduzca los nombres de los dos grupos para una comparación estadística en las variables de datos A y B y designe el número de repeticiones de simulación de permutación en la variable reps. Solo se utilizaron 2,000 repeticiones para esta demostración para disminuir el tiempo de procesamiento.
Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón ejecutar sección en el menú del editor. Ejecute la figura del mapa de calor y los resultados del grupo y las secciones de valor P de forma independiente utilizando el botón Ejecutar sección. El daño de montaje completo de una larva de cinco días después de la fertilización mostró una expresión transgénica brillante en el EPR en el momento de la detección de la ablación genética.
La criosección transversal de larvas no pobladas de seis días después de la fertilización mostró que la expresión transgénica se restringió a células RPE maduras con la expresión más brillante confinada a los 2/3 centrales del EPR. Las puntas de flecha indican microvellosidades apicales. La criosección transversal de una larva ablacionada un día después de la lesión reveló una interrupción de la morfología celular positiva de eGFP.
Las flechas indican núcleos picnóticos. Los daños de montaje entero de larvas post-fertilización de siete días no abraminadas mostraron pigmentación de EPR en todo el ojo y las larvas ablacionadas de dos días después de la lesión mostraron una zona de ablación ausente de pigmento en el EPR central. Una gráfica generada utilizando RpEGEN mostró similitud entre los grupos DMSO de nueve días post-fertilización no abiertos e IWR-1 a lo largo de la RPE.
La gráfica mostró una intensidad general de píxeles más ligera en los grupos DMSO e IWR-1 de cuatro días después de la lesión ablacionados, que parecían más ligeros en el IWR-1 ablacionado en comparación con cualquier otro grupo de tratamiento. Las diferencias en la pigmentación central de RPE fueron significativas al comparar las larvas tratadas con IWR-1 ablacionadas con los controles tratados con DMSO ablacionados. Usando este paradigma de ablación del pez cebra, hemos podido identificar varias vías de señalización molecular, como la señalización del viento que hemos mostrado aquí, que son reguladores críticos de la regeneración de RPE.
