제브라피쉬는 RPE를 포함한 다양한 조직 유형을 재생하는 고유 한 능력에서 독특합니다. 이 프로토콜은 RPE 재생 및 RPE 질환 관련 메카니즘을 구동하는 분자 경로를 확인하는데 사용될 수 있다. 다양성은이 방법론의 주요 이점입니다.
RPE 재생을 연구하는 것 외에도, 이 프로토콜은 RPE 퇴행성 과정과 눈의 인접한 조직에 대한 RPE 손상의 영향을 검사하는 데 활용될 수 있습니다. 인간을 포함한 포유류는 외상이나 퇴행성 질환으로 인한 대규모 RPE 부상을 복구 할 수 없습니다. RPE 재생 인자를 발견하는 도구로 제브라피쉬를 사용하는 것은 포유류 RPE 재생을 촉진하기 위한 중요한 단계입니다.
수정 후 5 일 동안 신선한 10 밀리몰 MTZ 용액을 준비하려면 MTZ 분말을 PTU가없는 시스템 물에 넣고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 격렬하게 흔들어서 완전히 섞으십시오. 10 밀리몰 MTZ 용액을 탁상 회전기 또는 쉐이커에서 실온에서 1 시간 동안 냉각하십시오. rpe65a:nsfB-eGFP 트랜스진으로부터 제브라피쉬 유충을 스크리닝하기 위해, 488 나노미터 여기 레이저가 있는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 트랜스제닉 eGFP 음성 유충으로부터 트랜스제닉 eGFP 양성 유충을 분리한다.
각성 선별 된 애벌레는 트리카인이없는 신선한 1.5X PTU가있는 페트리 접시에 직접 피펫팅하여 즉시 위로 올라갑니다. 스크리닝이 완료되면, eGFP 양성 유충을 페트리 디쉬의 두 그룹으로 더 분리하고, 한 그룹은 MTZ 치료를 받고 한 그룹은 절제되지 않은 대조군이 될 것이다. 그런 다음 절제 처리 접시에서 1.5X PTU를 제거하여 망막 색소 상피를 절제하고 새로 만든 10 밀리몰 MTZ 용액을 첨가한다.
또한 절제되지 않은 제어 접시에서 1.5X PTU를 제거하고 PTU없이 신선한 시스템 물을 추가하십시오. 정확히 24 시간 후에 10 밀리몰 MTZ 용액을 제거하고 PTU가없는 신선한 시스템 물을 추가하십시오. MTZ 네거티브 접시에 PTU가없는 신선한 시스템 물을 바꿉니다.
수정 후 나흘에 eGFP 양성 유충을 선별합니다. eGFP는 수정 후 나흘 동안 볼 수 있지만 다섯 번째 날에는 신호 강도보다 어두워 보입니다. eGFP 양성 유충을 약리학 적 치료를 위해 웰 당 10 마리 이하의 유충의 밀도로 페트리 접시 대신 여섯 웰 플레이트에 넣으십시오.
절제 및 절제되지 않은 유충을위한 별도의 여섯 웰 플레이트를 지정하십시오. 필요한 15 마이크로몰 IWR-1 또는 부피 매칭된 DMSO 비히클 제어 전처리 및 그에 따라 원뿔형 튜브에 1.5X PTU의 분취량을 결정한다. IWR-1 스톡을 1.5X PTU에 첨가하여 15 마이크로몰 IWR-1의 최종 농도를 달성한다.
일치하는 DMSO 스톡의 볼륨을 1.5X PTU에 추가합니다. 볼텍싱에 의해 잘 혼합하고 화합물의 용해를 육안으로 확인한다. 6 웰 플레이트의 eGFP 양성 유충에서 1.5X PTU를 제거하고 갓 만든 0.06 % DMSO 또는 15 마이크로 몰 IWR-1 처리의 웰 당 5 밀리리터를 추가하십시오.
다음날 RPE를 폐지하십시오. 수정 후 5 일 동안 절제되지 않은 여섯 웰 플레이트와 PTU가없는 담체계 물 또는 원뿔형 튜브에 10 밀리몰 MTZ 용액의 적절한 부피를 분취량하는 데 필요한 약리학 적 및 비히클 제어 처리의 양을 결정하십시오. IWR-1 및 DMSO 스톡 솔루션을 이전에 수행한 각 원뿔형 튜브에 추가합니다.
볼텍싱에 의해 잘 혼합하고 화합물의 용해를 육안으로 확인한다. 지정된 비절제 및 절제 6웰 플레이트에서 1.5X PTU로 0.06%DMSO 및 15마이크로몰 IWR-1 전처리를 제거한다. PTU 및 MTZ 용액 처리없이 적절한 담수 시스템으로 보충하십시오.
정확히 24 시간 후에 10 밀리몰 MTZ 용액에서 0.06 % DMSO 및 15 마이크로 몰 IWR-1 처리를 제거하고 PTU가없는 담수 처리수에서 처리하여 보충하십시오. 0.06%DMSO 및 15 마이크로몰 IWR-1 처리를 절제되지 않은 6웰 플레이트에 PTU가 없는 담수에서 보충하십시오. 유전자 절제 후 유충 유지를 위해 스테레오 현미경에서 투과 광 조명을 사용하여 생체 내에서 절제의 성공과 정도를 모니터링합니다.
피지를 사용하여 RPE 영역 또는 ROI를 생성하려면 여덟 비트 TIFF 이미지를 열고 이미지를 선택하여 등쪽이 위로 올라가고 원위가 남도록 이미지의 방향을 바꿉니다. 마지막 명령의 경우 해당 이미지에 필요한 방향성에 가장 적합한 옵션을 선택합니다. 분석, 도구, ROI 관리자를 선택하여 ROI 관리자를 시작하십시오.
이미지, 확대/축소 및 DAPI와 브라이트필드 채널 간에 전환을 사용합니다. 효율성을 위해 바로 가기 키를 사용합니다. RPE의 정점 측면이 외부 제한 멤브레인의 팁에서 인접하는 지점을 식별하고 이 해부학적 랜드마크를 ROI 시작점으로 사용합니다.
피지 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 사용하여 DAPI 및 Brightfield 이미지 채널과 이미지 확대/축소 기능을 사용하여 RPE ROI를 생성하여 정점 및 기본 RPE 경계를 식별합니다. ROI의 등쪽 및 복부 끝을 무뚝뚝 거리거나 반올림하는 대신 날카로운 지점으로 가져 오십시오. ROI 관리자에서 추가를 클릭하여 ROI를 추가합니다.
더 많은 것을 선택하여 ROI 파일을 저장하고 ROI 관리자 내에 저장하십시오. rpegen을 두 번 클릭하십시오. m 파일을 편집기 창에서 엽니다.
rpegen의 사용자 정의 변수 섹션 아래에서. m 파일, roi 파일, tiff 이미지 파일 및 출력 파일을 저장해야하는 폴더의 디렉토리 위치를 입력하십시오. 내보낼 매트 파일의 그룹 이름과 TIFF 이미지 스택에서 Brightfield 채널의 위치를 입력합니다.
MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 실행 단추를 클릭하여 스크립트를 실행합니다. MAT 파일을 저장하면 세 개의 패널 그림이 나타나고 각 이미지 실행에 대한 출력 디렉토리에 PDF로 저장됩니다. 이러한 품질 관리 PDF가 출력 폴더에 저장되고 마지막 그림이 사라질 때까지 기다리십시오.
개별 PDF를 열고 모든 ROI가 브라이트필드 이미지와 일치하는지 확인합니다. rpegen_permplot을 두 번 클릭합니다. m 파일을 새 편집기 탭에서 엽니다.
단일 사용자 정의 변수 섹션 아래에 rpegen을 실행할 MAT 파일이 들어 있는 출력 폴더의 디렉토리 위치를 입력합니다. m 스크립트. 로드할 각 MAT 파일 이름을 입력합니다.
편집기 메뉴에서 실행 섹션 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 두 번째 섹션에서는 데이터 A 및 데이터 B 변수에 통계 비교를 위해 두 그룹의 이름을 입력하고 reps 변수의 순열 시뮬레이션 반복 횟수를 지정합니다. 이 데모에는 처리 시간을 줄이기 위해 2, 000 reps 만 사용되었습니다.
편집기 메뉴에서 실행 섹션 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 히트 맵 그림 및 그룹 결과 및 P-값 섹션을 실행 섹션 단추를 사용하여 독립적으로 실행합니다. 수정 후 5 일 유충의 전체 마운트 손상은 유전자 절제에 대한 스크리닝 당시 RPE에서 밝은 전이유전자 발현을 보였다.
수정후 6일간 절제되지 않은 유충의 횡단 냉동절은 전이유전자 발현이 RPE의 중심 2/3에 국한된 가장 밝은 발현을 갖는 성숙한 RPE 세포로 제한됨을 보여주었다. 화살촉은 정점 미세 융모를 나타냅니다. 손상 후 하루 동안 절제된 유충의 횡단 냉동 절제술은 eGFP 양성 세포 형태학의 파괴를 드러냈다.
화살표는 pyknotic 핵을 나타냅니다. 절제되지 않은 칠일 후 수정 후 유충의 전체 마운트 손상은 눈 전체에 RPE 색소 침착을 나타냈고, 완화된 이틀 후 부상 후 유충은 중앙 RPE에 색소가 없는 절제 구역을 나타냈다. RpEGEN을 사용하여 생성된 플롯은 RPE의 길이에 걸쳐 절제되지 않은 9일 후 수정 후 DMSO와 IWR-1 그룹 사이의 유사성을 보여주었다.
플롯은 완화된 나흘간의 손상 후 DMSO 및 IWR-1 그룹에서 전체적으로 더 가벼운 픽셀 강도를 나타냈으며, 이는 다른 치료 그룹과 비교했을 때 절제된 IWR-1에서 가장 가벼워 보였다. 중앙 RPE 색소침착의 차이는 절제된 IWR-1 처리된 유충을 절제된 DMSO 처리된 대조군과 비교할 때 유의하였다. 이 제브라피쉬 절제 패러다임을 사용하여, 우리는 RPE 재생의 중요한 조절자인 바람 신호와 같은 몇 가지 분자 신호 전달 경로를 확인할 수 있었습니다.
