Este protocolo es significativo porque nos permitió identificar si una muestra de paciente contenía anticuerpos patógenos. La principal ventaja de esta técnica radica en su capacidad para diferenciar la reactividad entre antígenos de superficie e intracelulares, que no pueden ser fácilmente discriminados por otros métodos. Las neuronas culturales del hipocampo se utilizan para identificar nuevos anticuerpos.
La identificación de estos nuevos anticuerpos permite finalmente el inicio de un específico en monoterapias para mejorar los resultados de los pacientes. Esta técnica es importante porque puede extenderse a todo el campo de las enfermedades relacionadas con anticuerpos patógenos dirigidos a proteínas de superficie neuronal. Sosteniendo la cabeza del embrión con pinzas curvas finas, perfore las órbitas con un par de pinzas rectas finas en un ángulo de 45 grados.
Luego suelte las pinzas curvas finas. Con la ayuda de tijeras quirúrgicas, diseccionar la piel y el cráneo comenzando desde el hueso occipital hasta el hueso frontal. Luego retire el cerebro con un par de pinzas curvas finas y recójalo en el plato de seis centímetros con hibernación más B27.
Una vez que se recuperan los cerebros de todos los embriones, use las pinzas rectas finas para separar sagitalmente los telencéfalos. A continuación, prepare un plato de 10 centímetros colocando gotas de hibernación más B27 a una distancia de un centímetro en un círculo, y coloque un telencéfalo por gota para visualizar a través del alcance de disección a un aumento de 1.25 X. Mientras trabaja bajo el microscopio, retire cuidadosamente el tálamo y pele las meninges para visualizar mejor el hipocampo.
Luego disecciona el hipocampo con las tijeras de resorte de precisión. Y colocarlo en el plato de 3,5 centímetros con hibernar más B27 e istrate dos. Repita el procedimiento para recoger todos los hipocampos.
Para la disociación enzimática del hipocampo, agregue un mililitro de tripsina al 2,5% en el tubo de 50 mililitros que contiene el hipocampo. Después de llevar el volumen en el tubo a cinco mililitros con HBSS, incubar el tubo durante 15 minutos en el baño de agua a 37 grados centígrados. Para diluir aún más la tripsina, agregue 10 mililitros de HBSS precalentado y vuelva a colocar el tubo en el baño de agua, establecido a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, use una micropipeta de 1000 microlitros para transferir el hipocampo que aparece como una masa de moco a un tubo de 50 mililitros. E incubar el tejido con seis mililitros de HBSS precalentado durante cinco minutos, como se demuestra. Para disociar el tejido mecánicamente, transfiera la masa del hipocampo a un tubo de dos mililitros con fondo cónico.
Después de agregar un mililitro de medio DMEM precalentado, homogeneice el pellet con una micropipeta de 1000 microlitros aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Asegurándose de no crear burbujas, repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces con una pipeta de vidrio previamente tirada con su punta en contacto con el fondo cónico del tubo hasta que la mezcla esté translúcida. Cuente las celdas antes de distribuirlas uniformemente en un plato de 3,5 centímetros con movimientos de agitación cruzada.
Una vez hecho esto, coloque el plato en la incubadora con 5% de dióxido de carbono. Para la inmunotinción fluorescente de células in vitro de 14 días, agregue la muestra que contiene anticuerpos Anti-NMDAR a los cubreobjetos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de una hora, tratar la muestra con formaldehído al 4% y PBS como una solución de fijación a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego lave la muestra empujada con PBS durante cinco minutos cada una, seguida de la adición de anticuerpo secundario de cabra anti-humano Alexa Fluor 488 en una dilución a 1000 durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, monte los cubreobjetos que contienen la muestra con un medio de montaje líquido y aspire cualquier líquido restante. Visualice las neuronas con imágenes de fluorescencia.
Para obtener imágenes de calcio, use de 14 a 18 días células in vitro que se hayan cultivado en cubreobjetos. Antes de la obtención de imágenes, trate las células con el vector viral que codifica pAAV2 CAG GCaMP 5G a 2,5 veces 10 a la décima copia del genoma por mililitro durante cinco a siete días. Un día antes de la toma de imágenes, incubar las células con la muestra del paciente durante 24 horas.
El día de la imagen, prepare la configuración y ajuste la cámara celular del microscopio a 37 grados centígrados. Llene el carril con agua destilada, infundirlo con 5% de dióxido de carbono para mantener las condiciones fisiológicas celulares. Después de cubrir las células con solución fisiológica extracelular, transfiéralas a la cámara celular del microscopio.
Agregue 10 NBQX micromolares para bloquear los receptores AMPA y KA, y visualice la respuesta del receptor NMDA. Adquiere la película de cuatro minutos con los fotogramas grabados cada 100 milisegundos. Poco después de comenzar la adquisición, agregue una solución de estimulación al plato.
Tras la estimulación, extraer la señal fluorescente a lo largo del tiempo del cultivo incubado con el control y las muestras de líquido cefalorraquídeo o LCR del paciente utilizando software de procesamiento como Image J.It se observó que las células en un día in vitro se distribuyeron uniformemente y se adhirieron a la placa con una lámina que se desarrolla alrededor del cuerpo celular y neuritas menores que comienzan a extenderse. Después de algunos días en cultivo, las neuritas se extendieron una corta distancia y las células mostraron una polarización significativa. La red neuronal siguió creciendo y se volvió compleja.
A los 18 días, las neuronas estaban maduras, interconectadas y construyeron la red neuronal. Las imágenes fluorescentes representativas muestran neuronas maduras a los 18 días utilizando marcadores selectivos. La incubación de los cultivos con las muestras de pacientes produjo una intensa señal de fluorescencia ya que contiene los autoanticuerpos que reconocieron el receptor NMDA presente en la superficie de las neuronas.
Por el contrario, las muestras de control no produjeron señal fluorescente cuando se administraron a los cultivos neuronales. La aplicación de NMDA aumentó la intensidad de fluorescencia como lo indica un cambio en la fluorescencia verde intracelular. Cuando se aplicó el estimulador, las neuronas tratadas con la muestra de LCR de control mostraron una mayor diferencia en la intensidad de fluorescencia que las células tratadas con la muestra de LCR de los pacientes.
La identificación de propiedades y la disección del hipocampo determinan la pureza de los cultivos. La agregación celular es un factor clave, especialmente cuando se utilizan los cultivos con fines de obtención de imágenes. Además, las neuronas cultivadas del hipocampo se pueden utilizar para identificar nuevos anticuerpos y sus antígenos diana cuando se combinan con técnicas de inmunoprecipitación y espectrometría de masas.
Esta técnica ha permitido la caracterización de una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos. Por lo tanto, es esencial en el estudio del nuevo campo de la nanoinmunología.
