Este protocolo se puede utilizar para medir con precisión el número de copias de ADN mitocondrial presentes en células individuales y el nivel de ciertos tipos de mutación del ADN mitocondrial. Los métodos anteriores pueden realizar con precisión estas mediciones en muestras de tejido que contienen muchas células. La principal ventaja de esta técnica es que podemos hacer las mismas mediciones en células individuales.
Este método es particularmente útil para aquellos que estudian las mitocondrias y tendrá amplias aplicaciones en este campo. El aislamiento efectivo y la lisis de células individuales es clave para esta técnica. La experiencia previa con la clasificación de células individuales sería muy útil.
Para comenzar, prepare la mezcla maestra para la PCR sin la muestra de ADN en hielo, como se describe en el texto. Después del vórtice brevemente, distribuya el volumen requerido de la mezcla maestra preparada a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR de generación de gotas, organizando las muestras en columnas completas. A continuación, agregue la mezcla maestra a cualquier pozo vacío en columnas incompletas para usarlas como controles que no sean de plantilla.
Luego agregue el ADN de entrada a cada pozo para hacer que el volumen total de cada pozo sea de 22 microlitros. Selle la placa con un sello adhesivo y colóquela en un agitador a 2000 RPM durante un minuto. Luego centrifugar la placa a 1000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados antes de colocarla en hielo.
Para la generación de gotas, primero asegúrese de que el generador de gotas esté encendido y verifique si una botella de aceite generador de gotas está cargada en la posición E de la plataforma de instrumentos. A continuación, haga clic en Configurar placa de muestra en la pantalla táctil. Después de seleccionar todas las columnas de la placa de muestra que contienen las muestras o espacios en blanco, haga clic en Aceptar para confirmar la configuración de la placa.
A continuación, cargue los cartuchos del generador de gotas en la posición B en la plataforma de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes y coloque un canal de residuos de punta vacío en la posición C. Luego cargue las cajas de puntas del filtro con las tapas retiradas para colocar D en el escenario de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes. A continuación, retire el sello adhesivo antes de cargar la placa de muestra para colocar F de la plataforma de instrumentos para que la luz se vuelva verde. También cargue una placa vacía de recolección de gotas de 96 pocillos colocada en un bloque frío, preenfriada a menos 20 grados centígrados, en la posición G para que la luz se vuelva verde.
Haga clic en Iniciar generación de gotas en la pantalla táctil del instrumento y la tapa del generador de gotas se cerrará automáticamente. Una vez que se complete la generación de gotas, verifique visualmente la placa de recolección de muestras para confirmar que hay una capa de emulsión de gotas por encima de la fase de aceite en cada pozo. A continuación, encienda el sellador de placas y ajuste la temperatura a 180 grados centígrados y el tiempo de sellado a cinco segundos.
Permita que la máquina alcance la temperatura de funcionamiento. Luego coloque la placa de recolección de muestras en el soporte de la placa del sellador de placas y coloque un sello de aluminio nuevo en la parte superior de la placa con la línea roja hacia arriba. Cuando el sellador de placas haya alcanzado su temperatura de funcionamiento, pulse expulsar en la pantalla táctil del instrumento.
Después de colocar el soporte de la placa en el cajón del sellador de placas, presione el sello para cerrar el cajón. Una vez que se complete el sellado, el cajón se abrirá automáticamente. Retire la placa sellada y colóquela sobre el bloque frío.
Luego apague el sellador de placas. Para ejecutar la PCR, coloque la placa de recolección de gotas sellada en una máquina de PCR con un bloque de pozo profundo de 96. Una vez completada la PCR, encienda el lector de gotas y la computadora conectada.
Cargue la placa con las muestras post-PCR en el soporte de la placa del lector de gotas. Mientras mantiene la tapa de aluminio en la placa de muestra, coloque la cubierta en la parte superior del soporte y asegúrela en su lugar con clips de bloqueo negros. A continuación, para abrir la tapa del lector de gotas, presione el botón de abrir/cerrar.
Luego cargue el soporte de la placa del lector de gotas con la placa de muestra en la cámara del lector y colóquela de forma segura sobre la base magnética. Vuelva a pulsar el botón de apertura/cierre para cerrar la tapa. Abra la interfaz del software de análisis.
Seleccione la pestaña Agregar placa, haga clic en Agregar placa y, a continuación, en Configurar placa. En la pestaña Información de placa, ingrese un nombre de placa, seleccione Supermix for Probes, No DUTP en el menú desplegable Supermix e ingrese un nombre de archivo en Save Data File As.In la pestaña Well Selection (Selección de pozos), resalte los pozos que se analizarán y haga clic en Include Selected Wells (Incluir pozos seleccionados). Luego, en la pestaña Información del pozo, seleccione los pozos que desea anotar.
Seleccione Cuantificación directa en el menú desplegable Tipo de experimento. A continuación, rellene los cuadros Descripción de muestra, Tipo de muestra y Nombre de destino, y agregue notas de pozo o notas de placa según sea necesario. A continuación, haga clic en Aplicar.
Una vez completada la configuración de la placa, haga clic en Iniciar ejecución. Para el análisis de resultados, seleccione la ficha Análisis de datos y abra el archivo que se va a analizar en el menú Mis archivos de datos. A continuación, haga clic en la ficha Amplitud 1D para experimentos de un solo color o en la ficha Amplitud 2D para experimentos de dos colores.
A continuación, seleccione los pozos que requieren umbral. Utilice la herramienta Modo de línea de umbral para aplicar manualmente el umbral en el espacio libre entre las poblaciones positiva y negativa en la gráfica de amplitud, asegurándose de que la cruz se coloque de tal manera que las cuatro poblaciones de gotas estén claramente separadas. Una vez aplicado el umbral para todas las muestras, exporte los resultados como un archivo csv para su posterior análisis haciendo clic en la pestaña Tabla de datos, Importar/Exportar y seleccionando Exportar datos visibles a CSV.
Introduzca un nombre de archivo adecuado y haga clic en Guardar. Los procedimientos de PCR y lectura de gotitas utilizados en este protocolo demostraron la presencia de poblaciones claramente separadas de gotitas positivas y negativas, tanto en los canales fam como hexadecimal. Las poblaciones de ADN mitocondrial positivas para ambas sondas también podrían distinguirse de los lisados unicelulares.
Este método también mostró que para las muestras con deleciones en el ADN mitocondrial, está presente una población mixta de gotitas doblemente positivas y gotitas positivas solo para la porción no eliminada del ADN. Este método se ha utilizado con éxito para contar el número de copias de ADN mitocondrial por célula en una variedad de células de mamíferos, incluidos ovocitos de ratón y células embrionarias primarias de ratón. Además, en células con heteroplasmia de alta deleción, se encontró que la población positiva para una sola sonda era significativamente mayor que la población doble positiva.
Sin embargo, en células con heteroplasmia de baja deleción, ambas poblaciones eran de tamaño similar. Por lo tanto, los resultados precisos siempre aseguran que la generación de gotas haya sido exitosa y que el umbral se haya aplicado adecuadamente utilizando la vista de amplitud 1D o 2D. El lisado no utilizado se puede usar para otros ensayos de células individuales, como la pirosecuenciación, que puede medir la heteroplasmia de polimorfismo de nucleótido único.
El desarrollo de esta técnica nos ha permitido realizar mediciones precisas del número de copias de ADN mitocondrial y la heteroplasmia de deleción en células individuales, lo que antes no era posible.
