Agradecemos a nuestros colaboradores, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar y el Dr. Samantha Cooper desde el centro Digital de la biología (Bio-Rad Inc. CA) por su diseño de ensayo; Nezar Rghei y el Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Canadá) para asesoramiento crítico cuando optimizar el protocolo de extracción de RNA; y Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello y Joellyn Enos ayuda con requisitos y seguimiento comercial.

Se siguen las instrucciones del fabricante para los reactivos enumerados a continuación, a menos que lo contrario se describe. Los ensayos PCR están disponibles en el mercado productos diseñados para detectar fusiones ROS1 y RET.
1. trabajo con RNA en preparación para transcripción reversa (RT)-dPCR: buenas prácticas de laboratorio
<ol><li>Crear un ambiente libre de Rnasa al trabajar con el ARN.<ol>
<li>Utilizar aerosoles disponibles en el mercado diseñados para inactivar contaminantes RNasas.</li>
		<li>Uso certificado libre de Rnasa reactivos, puntas y tubos. Utilizar puntas de barrera para las pipetas para evitar la introducción de RNasas o contaminación cruzada de las muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siempre use una capa del laboratorio para evitar que partículas de ropa en su muestra. Designar un laboratorio capa específico para usar con el procesamiento de RNA.</li>
	<li>Guantes para evitar la contaminación de la muestra de RNasas en piel. Cambiar guantes con frecuencia. Nota: Asumir las superficies del laboratorio están contaminadas con Rnasa ya que están expuestos al medio ambiente. Guantes en contacto con la piel, pelo, picaportes, manijas de congelador, rotuladores/markers, etc. se supone que ya no son libres de Rnasa.</li>
	<li>Descontaminar las pipetas, benchtops, centrifugadoras y otras superficies de trabajo con un ARNasa inactivación aerosol antes de usarlo.</li>
	<li>Si es posible, mantener un conjunto de equipos para uso con el ARN.</li>
	<li>Minimizar las interrupciones del flujo de aire en las áreas de laboratorio cuando se trabaja con muestras de RNA para evitar que las partículas caigan en muestras o contaminar el área de trabajo.</li>
	<li>Tienda purificado RNA a-80 ° c.</li>
	<li>Evitar congelar-deshiela múltiple de muestras de RNA, ya que esto puede causar degradación.</li>
</ol>2. generación de Material analítico de ARN para los controles positivos
<ol><li>Uso de ADN sintético diseño había publicado secuencias de mRNA para variantes de fusión de interés10.<ol>
<li>Para una variante de fusión determinado, seleccione una secuencia de fusión mRNA que incluye el sitio de fusión además de suficiente longitud flanqueando en cada lado para cubrir el amplicon PCR.</li>
		<li>Seleccionar secuencias nucleotídicas entre 50-250 nt para mímico el tamaño de RNA con plasma enriquecido de plaquetas en circulación.</li>
		<li>Agregar una secuencia de promotor de T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') en el extremo 5' de la secuencia de destino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordenar secuencias sintéticas como fragmentos trenzado doble del ácido desoxirribonucléico (ADN).</li>
	<li>Reconstituir el ADN sintético en tampón Tris-EDTA (TE) a una concentración final de 10 ng/μl.</li>
	<li>Convertir 60 ng de ADN sintético ARN mediante transcripción en vitro .</li>
	<li>Purificar las transcripciones del RNA con reactivo de fenol/guanidina basado en12.<ol>
<li>Incluyen la ADNasa I, libre de ARNasa para extraer ADN plantilla residual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir concentración de purificada en vitro RNA usando un fluorómetro disponible comercialmente con tintes de RNA específicas y normas. Asegúrese de que el ARN está dentro del rango aceptable para las normas solicitadas. Se puede requerir dilución.</li>
	<li>Confirman éxito transcripción por electroforesis del gel utilizando un gel de agarosa 2% mezclado con la mancha de gel de RNA y una escalera de RNA, incluyendo el rango de tamaño de 50-250 nt de alta gama.<ol>
<li>Carga 500 ng de cada uno en vitro RNA en un gel.</li>
		<li>Correr el gel a 5 V/cm.</li>
		<li>Visualizar bandas solo usando iluminación y documentar los resultados.</li>
		<li>Confirmar el tamaño esperado de la transcripción para cada una de las variantes de fusión (basadas en diseño en el paso 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmar la detección de cada uno en vitro RNA por RT-dPCR mediante análisis PCR específica variante emparejado (vea los pasos 5 a 8 del presente Protocolo).</li>
	<li>Opcional: Prepare una mezcla equimolar de en vitro RNA que contiene cada una de las variantes de fusión y el control del gen GUSB.</li>
	<li>Si se realiza el paso 2.9: confirmar la detección de cada una de las variantes de fusión incluidas en la mezcla de control de dPCR mediante ensayos PCR específicos de la variante (véanse los pasos 5 a 8 del presente Protocolo).</li>
	<li>Determinar concentración deseada entrada para controles positivos analíticos analizando las concentraciones oscilan entre 0.25 y 2.5 de fg de10. Elegir la concentración base de salida número de copia deseado.</li>
	<li>Tras la confirmación, preparar alícuotas de solo uso de 10 μl de ARN analítica para el control positivo (paso 4.4) y tienda a-80 ° c.</li>
</ol>3. donantes muestras
<ol><li>Recoger las muestras de sangre entera humana 10 mL en tubos 10 mL sangre (BCT) que contiene un conservante de RNA libres de células. Nota: Todos los donantes humanos se consentimiento para uso de investigación y no información de identificación de donantes específicos será recopilada o utilizada durante la prueba.</li>
	<li>Proceso de muestras de sangre entera dentro del plazo especificado por el fabricante BCT.</li>
	<li>Plasma humano normal combinado puede adquirirse de una fuente comercial para uso en el control positivo analítico. Preparar un solo uso, alícuotas de 1 mL de plasma humano normal agrupado los tienda a-80 ° c para su uso con el control positivo (paso 4.4).</li>
</ol>4. recuperación de la ARN del Plasma de la circulación
Nota: Es importante trabajar rápidamente durante este procedimiento.
<ol><li>Centrifugar tubos de sangre total a 200 x g durante 20 min.</li>
	<li>Recoger hasta 4 mL del plasma del tubo de la colección de sangre centrifugada utilizando una pipeta serológica. Tenga cuidado de no molestar o aspirar la capa de la capa anteada.</li>
	<li>Aislar el RNA circulante mediante un kit disponible comercialmente que puede capturar exosomas, plaquetas y ARN sin células de plasma. Aislar el RNA de la muestra control positivo junto a cada lote.</li>
	<li>
Preparar el Control positivo por cada lote de muestras clínicas como sigue:
	<ol>
<li>Descongelar 1 mL combinaron normal plasma humano alícuota (paso 3.3).</li>
		<li>Descongele la parte alícuota 10 μl analítica RNA (paso 2.12).</li>
		<li>Preparar el control positivo agregando 10 μl RNA analítica en la muestra de plasma humano normal una vez que el etanol se ha agregado al plasma lisado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluir las muestras con 100 μl de agua libre de nucleasa. Proceder de inmediato con ARN limpieza y concentración.<ol>
<li>Las muestras pueden almacenadas en hielo húmedo y cubiertas, para hasta una hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Concentrado de RNA usando método de la columna base y eluir en 9 μl de agua libre de ARNasa.<ol>
<li>Proceder de inmediato al paso 5, o mantener las muestras en hielo húmedo hasta una hora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. reversa de la transcripción del RNA a cDNA
<ol><li>Convertir muestra circulación concentrada del RNA a cDNA utilizando un kit de reacción de transcripción reversa disponible en el mercado, incluyendo iniciadores al azar (véase tabla 1 de componentes). Nota: Iniciadores específicos gene son opcionales y pueden diseñarse para variantes de la prueba. Imprimaciones están diseñados en base a la blanco de secuencia de ARN. Utilizar secuencias variante de fusión del punto 2.1.<ol>
<li>Incluyen ninguna muestra de control de la transcriptasa inversa y ninguna muestra de control de RNA (véase tabla 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar el cDNA de la reacción de transcripción reversa usando una ADN disponible en el mercado concentrador spin columna. Nota: Este paso facilita la extracción de las enzimas, cartillas y libre Deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs).</li>
	<li>Utilice cDNA inmediatamente en reacciones de PCR o almacenar a-80 ° c.</li>
</ol>6. digital PCR
Nota: Esta PCR es específico de gota PCR digital (véase Tabla de materiales).
<ol><li>
Precauciones de la mezcla PCR.
	<ol>
<li>Guantes un laboratorio desechables capa y nitrilo.</li>
		<li>Uso PCR mezclar los reactivos en una área de preparación de reactivos dedicados. No manipule el cDNA en el área de preparación sólo reactivo.</li>
		<li>Cubrir las puntas de prueba trabajando para protegerlos de la luz. Luz excesiva puede foto bleach el tinte fluorescente conectado a la sonda.</li>
		<li>Transporte de mezclas, cubiertas y protegido de la luz, en un área separada de pre-amplificación antes de ADNc debe ser agregado.</li>
		<li>CDNA a probar de añadir a la mezcla PCR en una campana de limpieza PCR situado en zona de pre-amplificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar mezclas PCR para un volumen final de reacción de 20 μl según tabla 2.</li>
	<li>Distribuir la mezcla PCR + cDNA para placas PCR. Nota: Como una guía se recomienda el uso de un diseño de la placa.</li>
	<li>Cubrir la placa con un sellador de placas desmontables.</li>
	<li>Centrifugue las placas brevemente para recoger muestras en la parte inferior de los pozos.</li>
	<li>Mezclar en agitador de placa en una posición baja para 10 s.</li>
	<li>Centrifugue las placas brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del pozo.</li>
	<li>Retire el sellador de placa. Realizar generación de gotas de mezcla de cDNA PCR ya sea con un sistema de generación de gotas manuales o automáticos.<ol>
<li>Para la generación de la gota manual, transferencia de mezcla PCR de 20 μl a pozos de muestra en el cartucho de la generación de gotas. Añadir 70 μl de aceite de la generación de gotas. Cubierta con junta y transferencia cartucho de goma al generador manual gotita para iniciar la generación de gotas. Tras generación gotita, transferencia de gotas a una placa fresca de PCR utilizando puntas recomendadas por el fabricante. Aspirar y dispensar las gotas lentamente, durante 5 a 6 s cada una, sin tocar la abertura de la punta del cartucho de gotita o placa.</li>
		<li>Para la generación automatizada de la gotita, selle la placa con papel de aluminio y transferencia para el generador de gotas. Asegurar todos los consejos, cartuchos, y las placas están en su lugar antes de comenzar la generación de gotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siguientes gota generación y transferencia de las gotas a una placa PCR fresca, sellar con un sellador de placas de aluminio y placas de ciclo térmico utilizando la configuración en el cuadro 3.</li>
	<li>Después el termociclador ejecutar es completa, leer la placa utilizando un lector de gota. Crear un diseño de placa para el software lector que identifica la ubicación de controles, muestras, etc.y la carga en el software para empezar a leer.</li>
</ol>7. Análisis y revisión y generación de resultados
<ol><li>Analizar placa leer resultados utilizando software disponible comercialmente.</li>
	<li>Desplácese hasta el menú Analyze para ver diagramas de dos dimensiones (2D) amplitud.</li>
	<li>Evaluar la calidad de los datos examinando los datos de la gota.<ol>
<li>Evaluar los datos para los números de evento aceptado total usando el menú de eventos. Si hay menos de 10.000 eventos por pozo, evaluar cuidadosamente los datos de problemas adicionales.</li>
		<li>Verificar datos para amplitudes de fluorescencia aberrante. Las diferencias de amplitud significativa y las diferencias de concentración entre muestras replicadas indican mala manipulación o mezcla de muestras.</li>
		<li>Hacer notas de racimos de gota con patrones de rociado sobre un eje de 45 grados, que es indicativo de gotitas de mala calidad o las muestras problema.</li>
		<li>Examinar los datos de Control positivo, No de la transcriptasa reversa (RT No) y No RNA Control (NRC) en primer lugar. Seleccionar todas las muestras de control y examinar la calidad del racimo por parcela 2D. Para umbral apropiado, una clara separación entre grupos de la gota debe ser evidente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada variante de ensayo, establecer el umbral basado en pozos de control.<ol>
<li>Establecer umbrales en parcelas 2D utilizando la herramienta de punto de mira para separar la población de gotas de la negativa doble de la población de gen control (marcada con sonda de 5'-hexachloro-fluoresceína-CE phosphoramidite), eje y y población gene variant, si presentan) marcada con fluoresceína amidite sonda de OR 6-carboxyfluorescein), eje x.</li>
		<li>Suma de copias de cada pozo replicar para una sola muestra.</li>
		<li>Expresar los resultados como el número de copias variables detectada. Nota: Para determinar el valor de corte analítico para llamar a una muestra positiva o negativa, ejecutar normal muestra de donante sano establecer (al menos 10 muestras individuales) a través del proceso finalizado y establecer el límite por encima de cualquier señal de fondo perceptible para la mutación de interés. Además, establecer el número de copias del gen de control necesaria para llamar a un resultado positivo o negativo. Este corte de gen de control funciona como un control interno de calidad (QC) para evaluar la cantidad y calidad de cada muestra de RNA que se procesa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. verificación de las condiciones de reacción RT-dPCR utilizando líneas celulares (opcionales)
<ol><li>Para comprobar la detección de variantes de fusión, utilice comercialmente disponibles líneas celulares que expresan la fusión de ROS1 o RET ARNm de interés. Proceda del siguiente modo:<ol>
<li>Homogeneizar las células congeladas en flash en una solución de lisis Guanidinio basado directamente en el estado congelado. Incluso breve deshielo antes de homogeneización puede causar la pérdida y degradación del RNA.</li>
		<li>Aislar el RNA utilizando columnas de spin de membrana de silicona diseñados para RNA.</li>
		<li>Medir la concentración de las muestras de RNA utilizando un fluorómetro con estándares y reactivos específicos de RNA.</li>
		<li>Diluir el RNA aislado en un fondo de tipo ARN de plasma u otra fuente comercial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llevar a cabo pasos de transcripción inversa de RNA a cDNA, PCR Digital y análisis de datos y revisión y generación de resultados mencionados en el presente Protocolo para confirmar la detección de la variante deseada.</li>
</ol>

<ol>
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H.M., L.J., K.A., G.A.P. son empleados de y tienen acciones en H.M. Biodesix, Inc., L.J. y G.A.P. son inventores Co en una solicitud de patente presentada por Biodesix, que abarca un sistema de prueba de diagnóstico para la detección de variantes genéticas en células no pequeñas en circulación cáncer de pulmón.

Reordenamientos RET y ROS1 componen ~ 3% de las mutaciones de controlador en el CPCNP población18. Aunque sea rara, la detección de estas alteraciones genéticas es vital. Pacientes de CPCNP con estas alteraciones pueden beneficiarse de terapias específicas que inhiben específicamente la actividad de la cinasa aberrante que resulta de la onco-proteína13. Algunas de estas terapias ya son aprobados por la FDA para uso en el CPCNP positivo ROS1, mientras que otros se han demostrado para ser eficaz contra RET en ensayos clínicos19.
Tecnología PCR digital ofrece una sensibilidad que es ideal para aplicaciones de biopsia líquida20. Ha habido una adopción importante de esta tecnología para el uso con circulación libre de ADN para la determinación de mutaciones del tumor en pacientes con NSCLC4,6,21,22,23 . Además de cfDNA, hemos desarrollado un protocolo diseñado para la medida robusta de las variantes de fusión más frecuentes en pacientes con NSCLC de circulación tumor RNA (figura 1A)10.
Nuestro protocolo establecido permite límites analíticos de detección hasta 0.2% (figura 2). Mientras que la dPCR RT es muy específica y sensible, los ensayos se limitan al panel de variantes de fusión conocidos que se eligen y multiplexado para la detección en el análisis de la polimerización en cadena. Por lo tanto, fusiones en ensayos de multiplexado deben seleccionarse cuidadosamente para asegurar una cobertura adecuada en la población de pacientes con NSCLC. Hemos diseñado con éxito los ensayos para RET y ROS1 que simultáneamente detectar ocho resultantes de variantes de fusión de los cambios de los loci RET o ROS1 y cubrir el 99% y el 88% de la población positivo RET y ROS1, respectivamente (figura 1B-C )17.
El flujo de trabajo de final de la prueba como se describe en este estudio incluye controles de lote para asegurar la consistencia de los resultados. Estos controles incluyen un nivel analítico positivo, así como dos controles negativos, que juntos garantizan que no haya contaminación o inhibición de la polimerización en cadena que ocurren dentro del lote (figura 3). Para garantizar la robustez del ensayo, se realizó un estudio utilizando los controles de lote durante un período de 21 días (figura 3D, H). Estos datos demuestran la consistencia del proceso de RNA según lo establecido en este protocolo.
Buenas prácticas de laboratorio y manejo adecuado de la RNA son componentes clave de asegurar resultados robustos y exactos. Espacio de laboratorio y equipo dedicado a utilizar con el ARN, limpieza del equipo después de cada uso, utilizando consumibles y reactivos libres de RNasa y aplicar un spray de inactivación de Rnasa al espacio de trabajo ayudan a reducir contaminantes RNasas. Consciente manipulación de las muestras de RNA por técnicos, incluyendo una capa del laboratorio dedicado, frecuentes cambios de guante, trabajando rápidamente a través del procedimiento de extracción de RNA, y mantenimiento de las muestras en hielo es de suma importancia para preservar la integridad de la muestra. Una vez que la RNA ha sido revés transcrito a cDNA, la muestra es de una forma más estable que es menos propensa a la degradación. Además de las prácticas que apoyan la integridad del RNA, las muestras y los componentes de la PCR se deben mantener en áreas segregadas para evitar la contaminación cruzada que puedan conducir a resultados falsos positivos. Los valores reactivos de PCR y preparación de mezclas principales PCR deben ser apartadas del plantillas de PCR y grandes se debe a la segregación amplificada plantilla (post-PCR) de todos los materiales previamente amplificados incluyendo reactivos, RNA y las muestras de cDNA. Finalmente, la correcta generación y manejo de mezclas emulsionadas de PCR antes de la amplificación es central para mantener la integridad de la gotita y dPCR óptimas condiciones. Medidas como estas son fundamentales durante la ejecución de este protocolo para obtener resultados consistentes y exactos. Todos los datos deben ser examinados por personal capacitado antes de la publicación de los resultados para asegurarse que se cumplan los parámetros de control de calidad todos. En el caso de resultados subóptimos (figura 4), el lote debe ser revisado por personal técnico y el Director del laboratorio y requerir volver a procesar.
RT-dPCR resultados pueden obtenerse tan pronto como 24 horas desde la recepción de la muestra y 95% de los resultados de las muestras en el aparato utilizado en este estudio de prueba (n = 984) notificaron al pedido médico en menos de 72 horas desde el momento de la recepción (figura 5). Este tiempo brinda a los médicos mucho la información molecular en un marco de tiempo que permite la iniciación de la terapia adecuada que necesita. Estos resultados están típicamente disponibles antes que las obtenidas mediante una biopsia de tejido convencional. Adicional para NSCLC y otros tipos de cáncer podrían ser desarrollados utilizando métodos similares basados en RNA circulantes y se beneficiarían con el mismo tiempo-a-resultados rápidos. Por ejemplo, medición de la transcripción de mRNA de ligando de muerte programada 1 (PD-L1) mediante RT-dPCR podría informar a los médicos sobre las opciones de inmunoterapia. También hay un creciente interés en la utilidad de la biopsia líquida y dPCR en el seguimiento de la eficacia terapéutica. Las indicaciones anteriores de reaparición del tumor mediante pruebas específicas variantes genómicas podrían permiten a los médicos ajustar los regímenes de tratamiento antes de que los pacientes son sintomáticos por estándar de medidas de cuidado como la proyección de imagen24. Protocolos como el reportado en este estudio son ideales para monitoreo debido a su no invasividad, sensibilidad, tiempo de vuelta rápido y la rentabilidad. El ensayo descrito en el presente documento proporciona resultados dentro de las 72 horas desde la recepción de muestras, con tasas de detección mínima de falsos positivos, que facilita las decisiones de tratamiento rápido y evita algunas limitaciones con base de tejido de prueba4.
Nuestro protocolo y datos demuestran un sistema de prueba robusta para la identificación de variantes de RNA de baja abundancia así como la posibilidad de mutación de base de sangre de prueba en la práctica clínica. Para aquellos pacientes que no tienen un conductor accionable mutación identificada por biopsia líquida específica rápida acerca como éste, la adición de más extenso genoma y proteoma pruebas de tejido y sangre puede proporcionar información clínica más amplia apoyar la planificación del tratamiento.

Hasta 25% de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) pacientes pueden no tener suficiente tejido disponible para probar en el momento del diagnóstico. Incluso en casos donde el tejido está disponible, puede no ser de suficiente cantidad y calidad para llevar a cabo aconsejable pruebas moleculares1,2. En casos donde hay suficiente tejido de una biopsia para perfiles moleculares, los pacientes pueden tener que esperar varias semanas o más para obtener los resultados, o iniciar el tratamiento sin resultados moleculares3,4. Sin embargo, es crítico que diagnóstico molecular informativo esté disponible dado el advenimiento de múltiples opciones de tratamiento para pacientes con CPCNP diagnosticados. La prueba de ADN libre circulante (cfDNA) de biopsia líquida es una solución a los retos de tejido tradicional prueba4,5,6. Opciones actuales de prueba para las mutaciones útiles en NSCLC uso cfDNA y un flujo de trabajo basado en la dPCR similar para la generación de resultado rápido, incluir el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) sensibilización de mutaciones ΔE746-A750 y L858R, mutación de EGFR resistencia T790M , Variantes del proto-oncogén KRAS (KRAS) y la variante de B-Raf proto-oncogene (BRAF) V600E. Aunque no ampliamente adoptado por el campo, derivado de tumor ARN mensajero (ARNm) de circulación aislados de biopsia líquida también puede proporcionar información clínica importante7,8,9. Anteriormente hemos desarrollado y divulgado sobre los métodos de detección multiplexada de las equinodermos microtúbulos asociados proteína como 4-anaplástico linfoma Receptor tirosina quinasa (EML4-ALK) fusión variantes del plasma de sangre10. En este estudio, hemos ampliado estos métodos para incluir objetivos de RNA multiplexados de orden superior para ROS1 y RET, cubriendo ocho variantes de fusión dentro de cada ensayo. El objetivo fue desarrollar una técnica rápida, sensible, específica y reproducible para la detección de estas variantes de la fusión del plasma de pacientes con NSCLC.
Se inicia el proceso de prueba en un consultorio médico usando RNA estabiliza sangre colección tubos11. Estos tubos contienen una preservativa así como inhibidores de la Rnasa de la célula. Las muestras son prioridad enviado durante la noche a las centralizada acreditado por la Universidad de CAP de patólogos americanos/clínica laboratorio enmiendas para la mejora (CLIA)-laboratorio acreditado (laboratorio clínico) para el procesamiento por personal competente. Una vez recibida por el laboratorio clínico, cada paso del proceso se lleva a cabo bajo aprobado procedimientos operativos estándar (SOP). Sangre se centrifuga para recuperar el plasma, que se utiliza para aislar el RNA que es de circulación libre en la sangre o dentro de encapsular moléculas, como los exosomas y plaquetas7,8,9. Para aislar el ARN de estos compartimientos, seleccionamos el sistema de recuperación de RNA basada en las comparaciones de varios métodos de extracción. El ARN aislado es concentrado y atrás transcrito a cDNA. Varias enzimas transcriptasa reversa y cartillas gene-específicas fueron evaluadas durante la optimización del método de síntesis de cDNA para maximizar ROS1 y RET destino transcripción conversión10. Esto es crítico para la baja abundancia circulando transcripciones, como variantes del tumor derivado de la fusión. Por último, hemos optimizado dPCR concentraciones cartilla y sonda para permitir la detección de multiplexado de RET o ROS1 variantes de fusión y el control del gen, glucuronidasa-β (GUSB). Entonces combinamos las mejores condiciones de cada uno de los estudios de optimización en un protocolo cerrado final antes de realizar los estudios de validación analítica descritos en este informe. Este protocolo y estos resultados proporcionan la base para un flujo de trabajo rápido y sensible para la detección rutinaria de variantes raras de la fusión en circulación.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

Hemos desarrollado nuevos métodos para el aislamiento y la caracterización del tumor derivado circulante el ácido ribonucleico (cRNA) para biopsia líquida base de sangre. Detección robusta de cRNA de sangre representa una solución a una necesidad fundamental en diagnóstico clínico. La prueba comienza con la colección de sangre en tubos de colección de sangre que contienen conservantes que estabilizan cRNA. Libres de células exosomal y RNA asociada a plaquetas es aislada de plasma en este sistema de prueba. El cRNA es revés transcrito a ADN complementario (cDNA) y amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). Las muestras se evalúan para el biomarcador de destino, así como un gen de control. Validación de la prueba incluyó límite de detección, exactitud y robustez estudios con muestras analíticas. El método desarrollado como resultado de estos estudios reproducible detectar múltiples variantes de fusión para ROS1 (proto-oncogene del C-Ros variantes 1; 8) y RET (reorganizado en proto-oncogene de la transfección; 8 variantes). Se ha optimizado el flujo de trabajo de procesamiento de muestra para que constantemente se pueden generar resultados dentro de 72 horas de la recepción de la muestra.

Este protocolo describe un sistema de prueba para la detección de variantes de fusión RNA para el uso en la medición de las mutaciones del conductor dentro del plasma de pacientes de CPCNP (figura 1A). La fusión mRNA fueron productos de la expresión de los cambios de RET y ROS1 más comunes en la población de CPCNP identificó13,14,15,16,17. Análisis PCR multiplexados entonces fueron diseñados para detectar las ocho variantes de transcripción más frecuentes para cada destino en NSCLC en una sola reacción. Los desplazamientos más comunes en el lugar geométrico de ROS1 generan asociaciones con las 5' porciones de CD74, SDC4, SLC34A2, EZR o TPM3 genes (figura 1B). Los desplazamientos más comunes en el lugar geométrico RET conducen a yuxtaposición con KIF5B, para que el ensayo cubre a seis uniones exón. Otros socios RET que incluyen los CCDC6 y TRIM33 (figura 1C). En total, los ensayos cubren aproximadamente el 88% de ROS1 y 99% de las alteraciones del RET sabidas para ocurrir en la población de pacientes de CPCNP17.
La especificidad de los componentes del ensayo se evaluó primero con ocho individuales en vitro RNAs que contienen la secuencia de ARNm para las transcripciones de la fusión por la ROS1 o RET multiplexado ensayos. Cada especie de RNA fue probado contra cada ensayo de variantes individual que comprende la versión multiplexada. No había ninguna reactividad cruzada de estos ensayos, demostrando así 100% especificidad analítica en el diseño multiplexado ensayos (datos no mostrados). Para determinar el límite inferior de detección del Protocolo de prueba, derivado de líneas celulares que expresan una variante de la fusión incluida en el ensayo de ARN total se mezclaron en un fondo de ARN normal en concentraciones de 5%, 1%, 0.2% y 0,04%. El multiplexado RET y ROS1 variante análisis PCR detectados tan poco como 0,2% variante de fusión (figura 2A-B). Además, una preparación de 5% objetivo línea celular derivada RNA (expresando una transcripción de la fusión de EML4-ALK) no se detectó con los ensayos multiplexados ROS1 y RET, lo que demuestra especificidad (figura 2A-B).
Prueba de precisión del proceso RT dPCR fue realizada para ambos ROS1 y analítica RET. material de control compuesto por equimolar en vitro RNAs fue procesado en tres concentraciones (alta, media y baja) mediante transcripción reversa y dPCR en tres diferentes ocasiones dentro del mismo día (intradía), en tres días consecutivos (entre días) y con dos operadores (inter-operador). Resultados de pruebas de precisión demostró una detección precisa de la transcripción de la fusión de intereses, así como un gen de control, GUSB, que se incluye como una métrica de control de calidad interna (figura 2-D).
Además del control interno GUSB, cada lote de muestras clínicas se ejecutó con un conjunto de controles de lote. Control positivo fue desarrollado de una mezcla de análisis in vitro RNA que representa cada una de las variantes de fusión en RT dPCR, así como analítica en vitro RNA para GUSB. Este ARN se enriquecieron en el plasma humano normal lisado durante la extracción de RNA y fue procesado junto con las muestras clínicas en todo el protocolo. El no control de la transcriptasa inversa (sin RT) era un control negativo para confirmar la ausencia de material contaminante en el flujo de trabajo de extracción de RNA y demostrar la especificidad de los cebadores de RNA. El control de la RT No fue generado usando el mismo material como control positivo, pero no incluye enzima dentro de la reacción de síntesis de cDNA. El no control de RNA (NRC) es un control negativo para confirmar la ausencia de contaminación de las transcripciones en los componentes de la reacción reversa de la transcripción. Este control fue introducido en el flujo de trabajo en la etapa de síntesis de cDNA, y se agregó agua en la reacción en lugar de una plantilla de RNA. Los controles RT sin y NRC deben ser negativos en ambos canales, si los resultados deben ser entregados. La tabla 1 enumera los componentes de la reacción reversa de la transcripción para cada control. Se muestran ejemplos de los diagramas 2D para cada uno de estos controles para la ROS1 (figura 3 A-C) y ensayos multiplexores RET ( C-e-Gde lafigura 3 ). Variantes de fusión fueron detectadas usando una sonda de amidite (FAM) de fluoresceína y se representan en el eje y, mientras que el gen control, GUSB, fue detectado utilizando una sonda de 5'-hexachloro-fluoresceína-CE phosphoramidite (hexadecimal) y es en el eje x. Estos controles por lotes se evaluaron en el transcurso de 21 días para determinar la robustez del ensayo. Gotas positivas fusión y GUSB control gen gotas observaron ROS1 y RET en todas las ejecuciones de 21 ejecutadas en el transcurso del estudio (figura 3D, H). Todos los controles negativos (RT sin y NRC) dieron resultados negativos a través de los 21 días (datos no mostrados).
La capacidad de solucionar problemas es un componente crítico de cualquier protocolo de pruebas a ejecutar en el ámbito de laboratorio clínico. Aquí, nos proporcionan ejemplos del mundo real de resultados óptimos utilizando el protocolo de RT-dPCR. El primero es un diagrama 2D ejemplo demostrando la importancia del no control de la transcriptasa inversa (figura 4A). En este ejemplo, mutantes gotas positivas estaban presentes aunque no hubo ninguna conversión de cDNA debido a la falta de la enzima. Este resultado fue probablemente debido a la dPCR cartillas amplificación de ADN genómico de objetivo. En este caso, diseño de un ensayo que abarca el intrón evitará que la amplificación de la DNA genomic. Alternativamente, una enzima DNasa Rnasa-libres se puede utilizar para eliminar el ADN contaminante, pero no es recomendable para la detección de objetivos raros, ya que podría producirse alguna degradación del RNA durante la incubación con la enzima. La siguiente parcela 2D ejemplo fue un NRC con gotas positivas en ambos canales (figura 4B). Esto indica contaminación en algún punto de la instalación de dPCR RT. En este caso, la recomendación es desechar cualquier potencialmente contaminados los reactivos utilizados en las pruebas de fondo descontaminar todo el equipo y vuelva a probar con componentes de la reacción fresca. La trama 2D ejemplo tercera presentada como un aerosol de gotas a lo largo de una línea de 45° (figura 4C). Esto es causado a menudo por corte y une de gotitas. Cuidado gotita manejo antes de ciclos térmicos es esencial, como las gotas son propensas a dañar. Se recomienda el uso de generación automatizada de la gotita, cuando esté disponible. Si transferir manualmente genera gotas, asegúrese de elegir las puntas ancha recomendadas y emplear la técnica de pipeteo cuidadoso. Transferencia de gota requiere aspiración lenta y dispensación, con cada lugar durante 5-6 segundos, y es esencial que el apertura de punta de la pipeta toque el cartucho de la gota o bien. Despachador, mantener la punta de la pipeta en el nivel del líquido y aumentar poco a poco como gotas dispensada (ver vídeo demostración). El ejemplo de la parcela 2D final demuestra una falta de separación entre las poblaciones de gotas positivas y negativas (figura 4). Esto puede tener varias causas. Inhibidores de la PCR de fuerte, como detergentes utilizados en almacenadores intermediarios de la lisis y un exceso de ADN altamente degradado, pueden causar pérdida de la separación. En este caso, considerar la adición de un paso de limpieza entre la síntesis de cDNA y dPCR (como se describe en el paso 5 del presente Protocolo). Finalmente, falta de separación también puede ser debido a las condiciones óptimas de amplificación, y también se debe considerar la optimización del paso de la polimerización en cadena.
Datos de paciente de mundo real 984 figura 5 representan tiempos de vuelta de la muestra y demuestra el carácter rápido de este flujo de trabajo de prueba. Resultados se informó que el médico tan pronto como dentro de 48 horas (79% de los casos) de la recepción de la muestra y en el 95% de los casos, dentro de las 72 horas. En conclusión, el uso de estabilizado circulación RNA sangre colección tubos, procedimientos de extracción de RNA optimizados de la sangre y RT-dPCR ejecutar según un protocolo optimizado con la apropiada interno y controles por lotes, puede proporcionar un sistema de prueba rápida para la detección precisa de fusión RNA variantes relevantes en el CPCNP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Figura 1 : Resumen de pasos de procesamiento muestra sangre para la detección de variantes de fusión mediante ensayos específicos de RET más prevalente y ROS1 variantes en el CPCNP. (A) prueba de la muestra se inicia cuando se extrae sangre entera y un BCT viene en el kit de colección de muestras para el laboratorio clínico. Circular de RNA se recupera de múltiples fuentes dentro del plasma enriquecido con plaquetas, atrás transcripción con imprimación específica gen y purificaron para el uso en dPCR. Las muestras se procesaron mediante un sistema comercialmente disponible que consiste en la generación de gotitas (emulsión), amplificación y conteo de gotas. Datos se analizaron utilizando el software disponible en el mercado. Resultados de la prueba son entonces documentados y comunicados al médico solicitando a prueba. El proceso está diseñado para trabajar dentro de un plazo de 72 horas desde la recepción de la muestra a liberación de resultado. Ocho variantes para ROS1 (B) y (C) RET están cubiertas dentro de los ensayos multiplexados. Adaptado de la página web Biodesix con autorización. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Figura 2 : Validación analítica. Líneas celulares expresan (A) SDC4 ROS1 fusión y fusión (B) CCDC6-RET se diluyeron en un fondo de ARN total humano de tipo salvaje (WT RNA). Con cada variante de la fusión, el límite de detección se estableció en 0,2% frecuencia variante con criterios previamente definidos para cada ensayo de variante. Todas las muestras por encima de este umbral también contienen por lo menos 21 copias del gen de control. Estándar de EML4-ALK (ALK) de 5% en un fondo de tipo RNA fue probada para demostrar la especificidad del ensayo, que fue confirmada por un resultado negativo. Estándares analíticos de RNA multiplexados se midieron en alta, media y bajas concentraciones de ROS1 (C) y (D) RET. precisión se evaluó en tres carreras en el mismo día (intradía), tres carreras en tres días consecutivos (entre días) y con dos operadores independientes (inter-operador). Se muestran los medios número de copias y desviaciones estándar. Adaptado de la página web Biodesix con autorización. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Figura 3 : Procesamiento de datos de robustez y ejemplos de Control de lote. Parcela 2D de la dPCR de ensayo ROS1 multiplexado no resultados para control positivo (A), (B) control de la transcriptasa reversa y (C) no hay control de plantilla del RNA. (D) los controles fueron funcionados en 21 días consecutivos (excepto fines de semana y festivos). Significa copia número +/-desviaciones estándar para ROS1 positivo control fueron 439 +-141. No de la transcriptasa reversa y sin controles de plantilla fueron también cada día, y eran todos negativos (datos no mostrados). Parcela 2D de la RET multiplexado ensayo dPCR no resultados para control positivo (E), (F) control de la transcriptasa reversa y (G) no hay control de plantilla del RNA. (H) controles fueron funcionados en 21 días consecutivos (excepto fines de semana y festivos). Significa copias +/-desviaciones estándar para RET positivo control fueron 586 +-182. No muestran ninguna de la transcriptasa reversa y sin controles de plantilla que también se ejecutan cada día y eran todos negativos. Adaptado de la página web Biodesix con autorización. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Figura 4 : Solución de problemas de dPCR RT. Parcelas de 2D que representa dPCR óptimo resultados cuando hay contaminación (A) en el no control de la transcriptasa inversa, (B) contaminación en el no control de RNA, (C) corte y une de gotitas y (D ) mal optimizado las condiciones de la polimerización en cadena o inhibición de la polimerización en cadena. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Figura 5 : Tiempo de respuesta (TAT). TAT (en horas) fue compilado para pruebas solicitando una variante de RNA (n = 984). Datos excluyen fines de semana, fiestas y muestras destinadas > 24 h debido a la incompleta información clínica en el laboratorio de formas de solicitud de prueba. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tabla 1: Preparación de los reactivos de reversa de la transcripción para controles de proceso.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix para sondas (no hay 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>set de 20 x objetivo variante cartillas/sondas (cartillas de 450 nmol/L, sonda de FAM de 250 nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 juego de primers/sonda control objetivo x (cartillas de 450 nmol/L, sonda HEX de 250 nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>agua libre de nucleasas</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Preparación de la mezcla principal de dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bicicleta paso</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Tiempo</td>
			<td># Ciclos</td>
			<td>Tasa de rampa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Activación enzimática</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recocido/extensión</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desactivación de la enzima</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hold (opcional)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>infinito</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Condiciones de ciclo termal.

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A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Una base de sangre de prueba para la detección de ROS1 y RET transcripciones de la fusión de circulación de ácido ribonucleico con reacción en cadena de polimerasa Digital

Detección de ácido ribonucleico (cRNA) de la sangre que circula es una necesidad en el diagnóstico clínico. Aquí describimos los métodos que caracterizan a cRNA de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas mediante reacción en cadena de polimerasa digital sensible y específico. Las pruebas de cumplen requisitos de diseño para detectar variantes de fusión dentro de las 72 horas.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K vistas.  Biodesix. Detección de ácido ribonucleico (cRNA) de la sangre que circula es una necesidad en el diagnóstico clínico. Aquí describimos los métodos que caracterizan a cRNA de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas mediante reacción en cadena de polimerasa digital sensible y específico. Las pruebas de cumplen requisitos de diseño para detectar variantes de fusión dentro de las 72 horas.

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The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

El estrés social Trier Protocolo de prueba para la inducción de estrés psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Investigación

Medicina

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

Endometriosis is a common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this study was to demonstrate the use of a blue dye (methylene blue) to stain peritoneal surfaces during laparoscopy (L/S) to detect the loss of peritoneal integrity in patients with pelvic pain and suspected endometriosis. Forty women with CPP and 5 women without pain were evaluated in this pilot study. During L/S, concentrated dye was sprayed onto peritoneal surfaces, then aspirated and rinsed with Lactated Ringers solution. Areas of localized dye uptake were evaluated for the presence of visible endometriotic lesions. Areas of intense peritoneal staining were resected and some fixed in 2.5% buffered gluteraldehyde and examined by scanning (SEM) electron microscopy. Blue dye uptake was more common in women with endometriosis and chronic pelvic pain than controls (85% vs. 40%). Resection of the blue stained areas revealed endometriosis by SEM and loss of peritoneal cell-cell contact compared to normal, non-staining peritoneum. Affected peritoneum was associated with visible endometriotic implants in most but not all patients. Subjective pain relief was reported in 80% of subjects. Based on scanning electron microscopy, we conclude that endometrial cells extend well beyond visible implants of endometriosis and appear to disrupt the underlying mesothelium. Subtle lesions of endometriosis could therefore cause pelvic pain by disruption of peritoneal integrity, allowing menstrual or ovulatory blood and associated pain factors access to underlying sensory nerves. Complete resection of affected peritoneum may provide a better long-term treatment for endometriosis and CPP. This simple technique appears to improve detection of subtle or near invisible endometriosis in women with CPP and minimal visual findings at L/S and may serve to elevate diagnostic accuracy for endometriosis at laparoscopy.

Loss of peritoneal integrity provides a new paradigm to understand and treat chronic pelvic pain in women with mild forms of endometriosis and can be easily detected using intraoperative instillation of dye at the time of laparoscopy.

Intraoperatoria detección de endometriosis sutil: un nuevo paradigma para la detección y tratamiento del dolor pélvico asociado con la pérdida de la integridad Peritoneal

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

In molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI) are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. PET is characterized by its excellent sensitivity and quantification ability while OI is notable for non-radiation, relative low cost, short scanning time, high throughput, and wide availability to basic researchers. However, both modalities have their shortcomings as well. PET suffers from poor spatial resolution and high cost, while OI is mostly limited to preclinical applications because of its limited tissue penetration along with prominent scattering optical signals through the thickness of living tissues.
 Recently a bridge between PET and OI has emerged with the discovery of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI)4-6. CLI is a new imaging modality that harnesses Cerenkov Radiation (CR) to image radionuclides with OI instruments. Russian Nobel laureate Alekseyevich Cerenkov and his colleagues originally discovered CR in 1934. It is a form of electromagnetic radiation emitted when a charged particle travels at a superluminal speed in a dielectric medium7,8. The charged particle, whether positron or electron, perturbs the electromagnetic field of the medium by displacing the electrons in its atoms. After passing of the disruption photons are emitted as the displaced electrons return to the ground state. For instance, one 18F decay was estimated to produce an average of 3 photons in water5. 
 Since its emergence, CLI has been investigated for its use in a variety of preclinical applications including in vivo tumor imaging, reporter gene imaging, radiotracer development, multimodality imaging, among others4,5,9,10,11. The most important reason why CLI has enjoyed much success so far is that this new technology takes advantage of the low cost and wide availability of OI to image radionuclides, which used to be imaged only by more expensive and less available nuclear imaging modalities such as PET.
 Here, we present the method of using CLI to monitor cancer drug therapy. Our group has recently investigated this new application and validated its feasibility by a proof-of-concept study12. We demonstrated that CLI and PET exhibited excellent correlations across different tumor xenografts and imaging probes. This is consistent with the overarching principle of CR that CLI essentially visualizes the same radionuclides as PET. We selected Bevacizumab (Avastin; Genentech/Roche) as our therapeutic agent because it is a well-known angiogenesis inhibitor13,14. Maturation of this technology in the near future can be envisioned to have a significant impact on preclinical drug development, screening, as well as therapy monitoring of patients receiving treatments.

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Use of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for monitoring preclinical cancer treatment is described here. This method takes advantage of Cerenkov Radiation (CR) and optical imaging (OI) to visualize radiolabeled probes and thus provides an alternative to PET in preclinical therapeutic monitoring and drug screening.

Cerenkov Luminiscencia Imaging (CLI) para la Vigilancia del Cáncer Terapia

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

Evaluación del vaciamiento gástrico en ratones diabéticos no obesos mediante un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoico prueba del aliento ácido

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of arthroplasty. Infection requires complex treatment, may result in long hospitalization and causes considerable costs. Multiple surgical revisions can be necessary in these patients, with a loss in function as well as in quality of life.
The routine preoperative diagnostics include blood examination for C-reactive protein (CRP) and other biomarkers, as well as joint aspirate analysis for cell count, differentiation, and culture. Intraoperative specimens for histology and microbiology are also standard procedure. The microbiological examination of removed implants with sonication, in combination with the implementation of molecular biology techniques in microbiology, represent two novel techniques currently employed to enhance the differential diagnostics of PJI.
We present here the step-wise procedure of analyzing joint aspirate and sonication fluid, using a cartridge-based multiplex polymerase chain reaction (PCR) system. Results were matched against conventional cultures and consensus criteria for PJI. Conventional microbiological cultures from tissue biopsies, joint aspirate and sonication fluid showed a sensitivity of 66.7%, 66.7%, and 88.9%, respectively, and a specificity of 82.3%, 54.6%, and 61.5%, respectively. The PCR diagnostic of the sonication fluid and the joint fluid showed a sensitivity of 50.0% and 55.6%, respectively, and both a specificity of 100.0%. Both PCR diagnostics combined had a sensitivity of 66.7% and a specificity of 100.0%. The multiplex PCR therefore presents a rapid diagnostic tool with moderate sensitivity but high specificity in diagnosing PJI.

Differential diagnostics in painful arthroplasty is crucial for treatment success. Joint aspiration is routinely performed preoperatively. Multiplex polymerase chain reaction of the joint aspirate and the sonication fluid, a feasible tool for quick pathogen detection from these samples is described.

Nuevos diagnósticos en artroplastia de revisión: reacción en cadena múltiplex de polimerasa y sonicación del implante

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

Examen de gusto: Una prueba breve y validada

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been modified into many versions. With the development of digital technologies, TMT is now modified to a digitized version. The present study demonstrated digital TMT (dTMT) performed on a computer, and Walking TMT (WTMT) on the floor. Both revealed more information compared with the traditional version of TMT.

Here, we present a protocol to show how to perform two types of cognitive assessment tools derived from the paper-pencil version of the Trail Making Test.

Prueba tradicional de realización de senderos modificada en nuevas herramientas de evaluación: digital y caminata haciendo prueba

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...