Determinar la localización subcelular de una proteína es fundamental para delinear su función adecuada y los mecanismos involucrados en ella. Este método puede ayudarnos a visualizar la localización subcelular de una proteína a nivel de ultraestructura. El inmunomarcaje mediado por puntos cuánticos es más estable, resistente al fotoblanqueo, tiene sus propios espectros de emisión, produce una alta densidad de electrones y muestra una mayor eficiencia y retención en los tejidos con una mejor penetración en los tejidos.
Múltiples pasos del proceso, es decir, fijación, grabado, bloqueo y concentración óptima de puntos cuánticos, son pasos difíciles de optimizar. Es aconsejable probar múltiples puntos de tiempo y concentraciones de los reactivos utilizados. Otro desafío es manejar cuadrículas para las que solo funciona la paciencia y, por supuesto, la práctica.
Demostrando el procedimiento estarán Chowdhury Abdullah, un becario postal, Naznin Remex, un estudiante graduado de mi laboratorio, y Brandon Hartman, supervisor de microscopía electrónica de nuestros servicios de microscopía electrónica. Después de anestesiar a los ratones y abrir la cavidad torácica, profundir el corazón usando glutaraldehído helado al 3% en 0.1 molar de tampón de cacodilato de sodio durante dos minutos. Use una aguja de calibre 25 de cinco por ocho pulgadas para introducir los fijadores en el corazón usando la presión de gravedad.
Inmediatamente después de que el corazón comience a llenarse con el fijador, levante el ápice del corazón para aliviar la presión. Corte los vasos debajo a uno o dos milímetros del corazón y permita que los líquidos drenen. Disecciona el corazón.
Retire las aurículas y deje caer los ventrículos en una placa de Petri que contenga glutaraldehído helado al 3% y cacodilato de sodio molar 0.1. Haga un corte de mariposa después de 30 a 60 minutos de fijación y coloque el ventrículo nuevamente en la placa de Petri. Picar el corazón con una cuchilla quirúrgica en cubos pequeños de un milímetro cúbico.
Fijar y sumergir el tejido cardíaco disecado en solución de glutaraldehído y cacodilato durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Después de 24 horas de fijación, lave el tejido en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 dos veces durante 20 minutos. Retire el tejido del tampón de cacodilato de sodio y sumérjalo en una solución de tetróxido de osmio al 2% durante cuatro horas a temperatura ambiente.
Después de la osmicación, sumerja el tejido en una solución de acetato de sodio al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja el tejido en una solución de acetato de uranilo al 2% durante una hora a temperatura ambiente. Después de la tinción de acetato de uranilo, deshidrate el tejido secuencialmente a través de los alcoholes graduados y la acetona.
Incruste el tejido deshidratado en resina epoxi de baja viscosidad como se describe en el manuscrito. Coloque el tejido en resina fresca en micromoldes de ocho milímetros y cure el tejido incrustado a 70 grados centígrados durante la noche. Después de encontrar el área de interés, usando un cuchillo ultra 45 grados, produzca secciones ultradelgadas de oro pálido.
Coloque estas secciones ultrafinas en el lado opaco de una rejilla de cobre de malla 200. Comience la tinción desenmascarando el antígeno poniendo 20 microlitros de solución de grabado metaperiodato en una película de parafina limpia. Coloque la rejilla seca con secciones de tejido en la gota de la solución de grabado.
Deje la rejilla de sección en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones de tejido grabadas colocándolas en una gota de agua destilada durante 60 segundos. Bloquee los aldehídos residuales colocando la rejilla de sección en una gota de solución molar de glicina 0,05 durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro para eliminar la solución de glicina residual. Coloque la rejilla de sección en 10 a 20 microlitros de solución de bloqueo durante 25 minutos a temperatura ambiente. Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro y coloque las secciones de la rejilla en diluyente de anticuerpos para acondicionarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Incubar las secciones de rejilla con anticuerpos primarios durante una hora y 30 minutos en una cámara humidificada. Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante cinco minutos cada una. Incubar las secciones de rejilla con anticuerpo secundario biotinilado durante una hora en una cámara humidificada.
Una vez que la rejilla esté seca, lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante cinco minutos cada una. Incubar las secciones de rejilla en QD conjugado con estreptavidina disponible comercialmente durante una hora en una cámara a temperatura ambiente. Evite la exposición a la luz cubriendo la cámara con papel de aluminio.
Después de secar los bordes de la rejilla con papel de filtro, lave las secciones de la rejilla colocándolas en gotas de agua durante dos minutos y seque los bordes de la rejilla para que se sequen. Inserte el portamuestras en la columna del microscopio y active el interruptor de la bomba para evaluar el goniómetro, seguido de la inserción completa del portamuestras en la columna del microscopio. Concéntrese bien en el área deseada.
Capture la imagen con una cámara digital de alta velocidad y guarde el archivo en formato tif. Las membranas mitocondriales, los lisosomas y el retículo endoplásmico o la interfaz mitocondrial de la membrana del retículo sarcoplásmico mostraron la presencia de puntos cuánticos marcados con Sigmar1. Las secciones del corazón se visualizaron utilizando inmunoglobulina G de conejo y puntos cuánticos como control de isotipo para el anticuerpo primario de conejo anti-Sigmar1.
Una cosa importante a considerar al trabajar en este protocolo es desenmascarar el tiempo para el antígeno. Si las secciones de tejido están grabadas durante demasiado tiempo, la solución de metaperiodato creará perforaciones en secciones delgadas de tejido. El etiquetado mediado por puntos cuánticos está ganando atención en la detección de tumores, el perfil molecular e inmunológico del tumor, y las imágenes de tejido allanando un nuevo camino para el diagnóstico médico.
Los puntos cuánticos también son útiles en el tratamiento de tumores a través de terapias fotodinámicas y anomalías oftálmicas mediante la administración de medicamentos a los ojos.
