Damos las gracias a los miembros de nuestro equipo, sobre todo Blache MC para la asistencia técnica, así como M Irla y Imhof B, por su apoyo y fructíferos debates. Las cifras de la deflación y el confinamiento reproducido por cortesía de Nature Methods. Este proyecto es apoyado por becas institucionales del CNRS, el INSERM y la Universidad de Marsella, y por ayudas económicas de la región de Provenza-Alpes-Costa Azul, Instituto Nacional del Cáncer, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, la ANR 2010 BLAN 1214 01) y Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR con el apoyo de una beca de la Ligue Nationale Contre le Cancer.

En este video, se presenta un solo experimento completo rastreo de partículas, utilizando los puntos cuánticos dirigidos a un receptor de membrana específico. El objetivo principal de este experimento consiste en la discriminación de los diferentes tipos de comportamientos de la difusión molecular de medición dentro de la membrana plasmática de las células vivas. En efecto, los movimientos moleculares que surgen en la membrana típicamente puede desviarse de difusión browniano al ser linealmente dirigido o confinado dentro nanodomains 26-29, por ejemplo. Nuestro objetivo es al mismo tiempo después de que muchos receptores como sea técnicamente posible, para proporcionar una instantánea de la variedad que surge en la dinámica que ocurren dentro de la membrana de una célula viva. Esto es en última instancia, espera que permita descifrar los mecanismos que regulan la señalización celular de los receptores de la superficie. 1. Cultivo Celular <ol><li> Preparar la muestra de células: el uso adherentes células COS-7, que expresan el receptor de forma endógena del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) 30. Cuandotrabajar con células vivas, sin antibióticos, asegúrese de no tener latencia sub-detectable la contaminación mediante el uso de técnicas adecuadas de estériles en todo momento durante la preparación. </li><li> Se cultivan las células en medio completo (DMEM con suero de ternera al 10%, 1% de glutamina, HEPES 1% y 1% de piruvato sódico, véase la tabla de reactivos específicos a continuación), a 37 ° C con 7% de CO 2, teniendo cuidado de tener en ellos sub-confluentes, el crecimiento exponencial antes de extenderse en Lab-Tek. </li><li> El día antes del experimento, se extendió 5.000 células / pocillo en 8 y cámaras (Lab-Tek) y se incuba durante la noche. Contando células asegura una densidad celular constante, por lo tanto una relación reproducible de cuántica puntos por celda. </li></ol> 2. Etiquetado de la célula Preparar cuánticos-puntos con un recubrimiento específico. Quantum-puntos son nanopartículas fluorescentes compuestos de semiconductores. Estas nanopartículas presentan un gran interés debido a que son muy brillantes y fotoestable en comparación con el clásicosondas fluorescentes 31,32, lo que permite el logro de una señal apropiada a ruido (SNR) para obtener imágenes de una sola molécula. <ol><li> Antes del experimento, producir fragmentos Fab contra EGFR de la línea celular de hibridoma (AcMo 108, ATCC HB 9764), mediante digestión con papaína como se ha descrito previamente 21. </li><li> Conjugado con biotina Fab, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-kit de biotinilación, Thermo Scientific, Fig. 1A).. </li><li> Utilizar cuántica puntos funcionalizados con estreptavidina (Invitrogen) y emisor a 605 nm (longitud de onda de emisión óptima para la brillantez, la detección y separación de autofluorescencia celular). </li><li> Preparar la solución de etiquetado en medio completo (véase la tabla de los reactivos específicos), con el fin de saturar las streptavidins presentes alrededor de los puntos cuánticos, así como para prevenir la agregación y la unión no específica a las células y al cubreobjetos. </li><li> Preparar dos soluciones intermedias:uno con los puntos cuánticos-estreptavidina y otro con biotina Fab, cada uno a 20 Nm. </li><li> Mezclar un volumen igual de estas dos soluciones: mezclar los puntos cuánticos con Fab en proporción de 1:1 para obtener una concentración final de trabajo de 10 nM Fab: cuánticos-puntos complejo. Usando una relación equimolar favorece la formación de mono-funcionalizados complejos compuestos por un puntos cuánticos y un fragmento Fab biotinilado. Esto favorece el etiquetado monovalente, limitando observaciones artefactos debidos a los receptores de reticulación 33,34. </li><li> Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando un agitador a 1.200 revoluciones por minuto para evitar la agregación. La mezcla es entonces listo para su uso en células vivas. </li><li> Se incuban las células en 100 l de mezcla durante 5 minutos a 37 ° C con 7% de CO 2. </li><li> Lavar las células con medio de imágenes no autofluorescente (tampón HBSS, HEPES 1%, ver tabla de reactivos específicos) previamente calentada a 37 ° C. </li><li> Retire con cuidado el exceso de etiquetas para evitar que las Naciones Unidasnecesario estropear la SNR por no unido, fuera de foco cuánticos-puntos, por lavado extensivamente cada pocillo con medio formador de imágenes, típicamente 5 veces a temperatura ambiente, con al menos 5 minutos antes de retraso del último lavado. </li></ol> 3. Configuración óptica La configuración de video-microscopía se compone de cuatro partes principales: <ol><li> Un microscopio invertido con un cubo específico de fluorescencia (FF01-457/50 excitación, dicroico FF495-DI02, y FF01-617/73 filtros de emisión, Semrock) y una gran apertura numérica (1,3 o 1,49) de inmersión en aceite objetivo 100x. </li><li> Una lámpara de mercurio de 100 W (acoplado al microscopio a través de una fibra óptica, evitando interferir con la termorregulación). </li><li> Una sensibilidad de 512 x 512 píxeles de alto EMCCD la cámara para obtener una buena relación señal ruido. </li><li> Una incubadora para mantener las muestras biológicas a 37 ° C durante el experimento. </li></ol> 4. Adquisición <ol><li> Seleccione las celdas aisladas y bien extendido. Estefavorece la extensión de lamellipodia bonito, plano, que mejor se adapte a buscar movimiento plano de las moléculas de la membrana. </li><li> Evaluar el estado fisiológico celular por su apariencia, tanto en la luz transmitida y fluorescencia: el tráfico vesicular intensa, ausencia de signos de necrosis o apoptosis, la autofluorescencia de baja y media-fuerte de puntos cuánticos de etiquetado (por lo general hasta 1.000 cuántica puntos por celular, ver fig. 1B, C). </li><li> Seleccione una densidad de etiquetado de alto, que es fundamental para el seguimiento al mismo tiempo receptores de la mayor cantidad posible. Esto es realmente limitado tanto por fisiológica (expresión en la superficie, la accesibilidad epítopo, el movimiento lateral) y los parámetros de algoritmos (no superposición de funciones de cálculo de punto (PSF), incluso teniendo en cuenta borrosa debido al movimiento, para permitir la detección adecuada y reconexión). </li><li> Para cada celda, primero adquirir una imagen de campo campo claro (preferentemente utilizando DIC, si está disponible) que además puede permitir la comprobación de la célula aspectoy los límites espaciales de la lamellipodia. </li><li> Guarda esta imagen con el mismo nombre que el video-pila (como cell1.tif y cell1.stk por ejemplo), en una subcarpeta denominada CID, ya que, con estos convenios, el algoritmo de forma automática se puede encontrar de nuevo la imagen correspondiente para cada pila. </li><li> Adquirir 1 a 3 videos por celular, de forma continua, por lo general a los 36 ms de tasa, la tasa más alta alcanzable en el fotograma completo con esta cámara. Sin embargo se puede adquirir a frecuencias más altas, de hasta 1-ms tasa, utilizando CCD dedicado con aumento de la sensibilidad y / o menos pixeles. La tecnología proporciona el marco de transferencia de retraso insignificante entre los marcos. </li><li> La mejora de electrones se multiplican siempre debe estar al máximo (justo debajo de la saturación, en su caso) para permitir alcanzar la sensibilidad sola molécula, con un número suficiente de SNR, por lo menos por encima de 20 dB (para la detección eficaz de pico 1), por lo general alrededor de 25-30 dB. </li><li> Por lo general adquieren 300 imágenes por vídeo, el pecadoce se reconstruyen las trayectorias de más de ~ 100 marcos, en promedio, en su mayoría limitados por largos eventos parpadeo. La frecuencia y la duración del vídeo se puede adaptar para una acción determinada, lo cual podría requerir más rastros, por ejemplo. </li></ol> 5. MTT Análisis <ol><li> Seleccione la ruta al directorio que contiene los archivos de video para evaluar un determinado conjunto de datos con Matlab u Octave. </li><li> Para iniciar el análisis totalmente automatizado 1,35, escriba el comando detect_reconnex23 en Octave, o MTT23i en Matlab. Este programa representa &quot;la versión 2.3, con interfaz de usuario&quot; y está disponible para su descarga, junto con la versión anterior 2.2. En primer lugar, muestra un interfaz gráfico listado de todos los parámetros utilizados, como se muestra en la fig. 2. </li></ol> 6. Los resultados representativos MTT analiza automáticamente cada grabadora de vídeo, para entregar las huellas de los objetivos detectados y estimados, complementados por más devestigaciones, como la detección de confinamiento. En última instancia, permite que las huellas de mapeo sobre las imágenes de células (Fig. 1C y 3). Descripción MTT El análisis de MTT núcleo se realiza sobre cada fotograma, invocando 3 tareas principales (Fig. 3): <ol><li> La detección de la presencia o ausencia de un objetivo (puntos cuánticos), dentro de un deslizamiento subregión sucesivamente centrado alrededor de cada píxel, donde se comparan dos hipótesis: o bien la presencia de una señal, con el PSF modelizado como un pico bidimensional gaussiana , o sólo el ruido, con un umbral bajo de falsas alarmas asegurar suficiente, con menos de una detección de falsos por cuadro. Esto conduce a un mapa de probabilidad de detección. Cada máximo local se considera como un objetivo putativo, asegurando que su nivel de probabilidad es mayor que un valor mínimo, fijado de acuerdo con la probabilidad deseada de falsa alarma (PFA). Este límite se fija lo suficientemente bajo como para discriminar de manera eficiente SIGnales de ruido, evitar en el mejor de detecciones espurias (PFA de 10 -6 por defecto, para asegurar que menos de un error en 512 x 512 imágenes de píxeles), al tiempo que permite una probabilidad suficientemente alta de detección, llegando a la teoría predice un óptimo. Tenga en cuenta que el requisito de utilizar una sub-región implica que los bordes de la imagen (3 píxeles, por un defecto de la ventana de 7 x 7 píxeles) no se puede evaluar. </li><li> Estimación, para cada objetivo detectado, de los parámetros pertinentes, como sub-píxel posición e intensidad de la señal. Por cada objetivo detectado, una de los mínimos cuadrados de Gauss-Newton ajuste se realiza próxima para estimar la posición, anchura y altura de la gaussiana detectado. Esto permite en particular la posición de sub-píxel del medio de contraste (10 a 20 nm para la precisión de los valores típicos de SNR y tintes inmóviles o difundir lentamente, aumentando hasta ~ 100 nm para la difusión de los colorantes a 0,1 m 2 / s). </li><li> Reconexión de los nuevos objetivos con elhuellas ya construido en los fotogramas anteriores. El conjunto de nuevos objetivos se corresponde con el conjunto de restos anteriores. Para este propósito, a fin de asignar a cada objetivo a una huella, si es posible, toda la información disponible estadística obtenida de la etapa de detección se utiliza, no sólo la posición, pero también intensidad, ancho, parpadeando y las estadísticas asociadas. Por lo tanto, los objetivos no sólo están asignados a la más cercana de seguimiento: en el caso de los rastros que cruzan, la intensidad, la velocidad, el ancho y el parpadeo se tendrán en cuenta. Esto ofrece la puntuación de reconexión estadísticamente óptimo. Esta estrategia evita, siempre que sea posible, la reconexión de polarización hacia los vecinos más cercanos. </li></ol> Picos detectados a posteriori puede ser rechazada si su estimación o reconexión falla. Un examen especial se encarga de la detección de nuevos picos, que iba a iniciar nuevas trazas. Esta prueba utiliza un más estricto de PFA (10 -7), ya que volver a conectar un máximo de un rastro puede ser interpretado de facto como la validación o<html> f su importancia (este criterio es, por definición, no es aplicable para nuevos picos). Trayectoria Análisis Confinamiento transitoria Posible está próximo evaluada por una función inversamente relacionada con la difusión local 24-29. La aplicación de un umbral permite definir limita o no episodios. Al iterar sobre ellos todos los rastros, podemos trazar la dinámica de la membrana, en términos de reclusión transitoria / frenar los acontecimientos. Esto puede ser alternativamente representada utilizando el binario o valores discretos de este índice confinamiento. De forma predeterminada, MTT realiza automáticamente las tareas, el ahorro de 8 parámetros máximos en un archivo de texto: el número de fotograma, i y la posición j, intensidad de la señal, el radio, que se compensan y parpadear, para cada fotograma de vídeo (grupo de 7 filas) y trace (columna) . Estos parámetros pueden ser recargadas en Matlab u Octave usando el script fread_data_spt para un análisis posterior de las huellas es decir, o intensidad de la señal, como se ejemplifica en el<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example secuencia de comandos en el apéndice. Otros análisis conducen a trazar huellas en cada celda (Fig. 1C y 3) y para proporcionar una distribución del histograma para los parámetros pertinentes, como el pico de intensidad, SNR o valores locales de difusión). Para cada archivo, media y desviación estándar de cada parámetro se guardan en un archivo de texto, junto con una imagen de los histogramas. Distribuciones logarítmicas, como para los desplazamientos cuadrados r 2, conducir a la media geométrica. El coeficiente de difusión D se calcula a partir de un ajuste lineal durante los cinco primeros puntos de la curva de MSD. Estos valores proporcionan una visión general de un experimento relacionado con la cinética de las reacciones celulares ejemplo o tratamientos farmacéuticos / enzimáticos que afectan a la organización de la membrana. Desde MTT es un código de fuente abierta, este aspecto puede ser fácilmente adaptado a cualquier investigación dedicada. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Seguimiento receptores de membrana dinámica por MTT. (A) los componentes de membrana, tales como el EGFR, se marcan con puntos cuánticos acoplados a los fragmentos Fab biotinilado (dibujo esquemático con escala aproximadamente correcta de cada molécula). (B) imagen fluorescente típica adquirida a partir de un en vivo de células COS-7, con el tiempo de exposición de 36 ms, que representa difracción limitada picos correspondientes a los receptores etiquetadas individualmente. (C) de salida del análisis MTT mostrando las trayectorias reconstituidas de los receptores, superpuesta a la imagen campo claro de la célula. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. MTT parámetros de entrada. Ejecución MTT23i abre una interfaz gráfica de usuario lista de todos los parámetros de entrada, los nombres y los valores predeterminados, como se describe en nuestra publicación anterior 1. En los parámetros del algoritmo, espacio y tiempo (ventanas de búsqueda, el radio máximo, la máxima difusión<html> y parpadeando) se encuentran en unidades adimensionales estándar, los píxeles y los marcos. Las calibraciones se pueden aplicar a posteriori, para convertir los resultados de salida. Los valores por defecto, lo que corresponde a una cascada 512BFT con un aumento de 100x, son píxeles Tamaño: 156 nm / pxl y la demora de fotogramas: 36 ms / frame. Los investigadores deben optimizar algunos parámetros críticos, tales como el coeficiente de difusión máxima esperada (&quot;Diff máximo&quot;) y la desaparición intermitente máximo (&quot;T off&quot;). Estos dos límites de espacio y tiempo son casi los únicos que necesitan ser modificadas para una determinada condición experimental, los otros que se establecen en valores predeterminados robustos. Por ejemplo, el número de falsas alarmas se fija directamente a asegurar menos de un error por cada millón de pixeles, por lo tanto, menos del uno por cuadro, que es satisfactoria en la mayoría de los casos. Todos los parámetros se guardan en un archivo de texto en la carpeta de salida, permitiendo que los usuarios puedan comprobar a posteriori los ajustes que se utilizaron para su análisis. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Los pasos principales del análisis MTT. A partir de una pila experimental de imágenes de fluorescencia, los picos son secuencialmente y detecta automáticamente, estimado por un ajuste gaussiano y vuelto a conectar más de marcos (primera gama de operaciones, parte superior del diagrama de flujo). Trazas adicional puede ser analizado para el confinamiento putativo, por ejemplo, conduciendo finalmente a un mapa dinámico de descriptores pertinentes (segunda gama de operaciones, parte inferior). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Etiquetado de valencia no tiene impacto en MTT. Para evaluar el posible sesgo introducido por medio del etiquetado multivalente artefactual, el análisis MTT se llevó a cabo para realizar un seguimiento de EGFR endógeno etiquetados con 2 esquemas diferentes, para generar y analizar mapas de trayectorias. (A) Los receptores fueron marcados con biotina Fab y cuántica dots605 estreptavidina, tal como se describe en el protocolo.En este caso, la valencia de varios de los puntos cuánticos y streptavidins puede resultar en varios receptores de acoplamiento a un solo colorante. (B) Los receptores fueron marcados con Fab directamente acoplado a un colorante orgánico, Atto647N. En este caso, un Fab, por lo tanto, un receptor, puede ser acoplado a más de un colorante. (C) La media de desplazamiento cuadrado (MSD) la curva se calculó para todos los rastros de cada celda, con la etiqueta, ya sea con puntos cuánticos como los tintes y Atto (gráficos de izquierda y derecha, respectivamente). Los coeficientes de difusión se calcula en forma lineal a lo largo de los cinco primeros puntos de la MSD (línea roja punteada). Cada sistema de etiquetado llevado a los valores de difusión similares (gráfico central). Qdot: cuántica dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: no significativo (t de Student test valor p&gt; 0,05).

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J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En una sola partícula de seguimiento, junto a los aspectos celulares y microscopía, el análisis representa una parte sustancial de la obra. Esto se dirige el algoritmo utilizado para realizar las tres tareas principales: la detección, la estimación y volver a conectar picos de más de cada fotograma. Pero el aspecto consecuente de este trabajo reside en la elaboración del propio algoritmo, que puede ser necesario adaptar a cualquier nueva investigación dedicada, fundamentalmente por los últimos pasos, extra (com...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Cos-7 línea celular </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5.000 células por pocillo </td></tr><tr><td> HBSS sin Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-así Lab-Tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Qdot-605 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Fab biotinilado (para la síntesis de los fragmentos Fab, véase la referencia 21) </td></tr><tr><td> Fab del AcM 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 g </td></tr><tr><td> NHS-biotina<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Completar medio </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Imagen mediana </td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 l </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Equipo </td><td> Empresa </td><td> Referencia </td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Lámpara fluorescente </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA objetivo 100x </td><td> Nikon </td><td> Plan Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1.49 NA objetivo 100x </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Cámara </td><td> Roper Científico </td><td> Cascada 512 B </td></tr><tr><td> Caja de termostato </td><td> Vida Servicios de Imágenes </td><td> La Caja </td></tr></tbody></table> Apéndice: script de ejemplo de análisis complementario de MTT función de MTT_example (nombre_archivo) %%% Ejemplos básicos que muestran cómo recuperar los resultados de salida de MTT %%% Para trazar cada trace, y para construir el histograma %%% De la intensidad de fluorescencia si nargin &lt;1% sin file_name siempre? archivos = dir (&#39;* STK.&#39;); si IsEmpty (archivos), disp (&#39;no existen datos en el directorio actual &quot;), el regreso, al final . nombre_archivo = archivos (1) nombre;% por defecto: en primer lugar el archivo stk disp ([&#39;con&#39; nombre_archivo &#39;por defecto&#39;]) final file_param = [nombre de archivo &#39;_tab_param.dat&#39;];% del archivo de salida %% De la carga de datos cd (&#39;OUTPUT23&#39;)% o (&#39;output22&#39;), de acuerdo a la versión utilizada % Descargo de responsabilidad: la versión 2.2 sólo genera 7 parámetros, % Un parámetro adicional, el ruido, se añadió en la versión 2.3 % Para leer todos los parámetros a la vez, en una sola tabla Tab_param% = fread_all_param (file_param); % TAb_i = tab_param (2:8: end, :); tab_j = ... % Para leer todos los parámetros (excepto frame_number) en tablas separadas % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3), el índice es del 3% porque el número de seguimiento y número de bastidor, no informativo, se descartan! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); % Del ciclo% sobre huellas N_traces size = (tab_i, 1); Tablas% son líneas de columnas N_traces N_frames de ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0;% no sólo los pasos intermitentes parcela (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (píxel)&#39;), ylabel (&#39;j (píxel)&#39;) título ([num2str &#39;trace #&#39; (ITRC)]) disp (&#39;Por favor, presione cualquier tecla para el rastro al lado &quot;), hacer una pausa final %% Fluo histograma N_datapoints = suma (tab_blk (:)&gt; 0);% parpadeantes medidas no sólo hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% con 2sqrt (N) contenedores xlabel (&#39;intensidad (UA)&#39;), ylabel (&#39;ocurrencia&#39;) título (&#39;histograma de la intensidad de fluorescencia partículas&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

Nuestro objetivo es obtener una descripción completa de los procesos moleculares que ocurren en las membranas celulares de diferentes funciones biológicas. Nuestro objetivo es la caracterización de la organización compleja y dinámica de la membrana plasmática en una sola molécula de nivel, mediante el desarrollo de herramientas analíticas dedicadas a una sola partícula de seguimiento (SPT) en alta densidad: Múltiples-Objetivo de Búsquedas (MTT) 1. Una sola molécula de videomicroscopía, ofreciendo milisegundos y resolución nanométrica 1-11, permite una representación detallada de la organización de la membrana 12-14 con precisión la cartografía descriptores tales como la localización de los receptores de la célula, la movilidad, el parto o interacciones. Volvimos a visitar el SPT, tanto a nivel experimental y algorítmicamente. Aspectos experimentales incluyeron la optimización de la configuración y el etiquetado de células, con un énfasis particular en alcanzar la densidad de etiquetado más alto posible, a fin de proporcionar una instantánea dinámica de una dinámica moleculars que se produce dentro de la membrana. Problemas algorítmicos en cuestión cada paso utilizado para la reconstrucción de las trayectorias: la detección de picos, la estimación y la reconexión, se dirigió a las herramientas específicas de análisis de imagen 15,16. Implementación de la deflación después de la detección permite que los picos rescate oculto inicialmente por los picos vecinos, más fuertes. Es de destacar que la mejora de la detección de un impacto directo en la reconexión, por la reducción de las diferencias dentro de las trayectorias. Las presentaciones han sido evaluadas utilizando simulaciones de Monte Carlo para la densidad de etiquetado diferentes y los valores de ruido, que normalmente representan las dos principales limitaciones de las mediciones paralelas con una resolución espacial y temporal de alta. La precisión nanométrica 17 obtenido por moléculas individuales, usando ya sea sucesiva de encendido / apagado óptica photoswitching o no lineal, puede entregar observaciones exhaustivas. Esta es la base de los métodos de Nanoscopia 17 como TORMENTA 18, PALM 19,20, 21 o RESOLFT STED 22,23, WHICH menudo pueden requerir muestras de imágenes fijas. La tarea principal es la detección y estimación de los escasos picos de difracción que emanan de una sola molécula. Por lo tanto, proporcionar las hipótesis adecuadas, tales como el manejo de una precisión de posicionamiento constante en lugar del movimiento browniano, el MTT es francamente adecuado para el análisis de nanoscópicos. Además, MTT fundamentalmente se puede utilizar en cualquier escala: no sólo para las moléculas, sino también para las células o animales, por ejemplo. Por lo tanto, MTT es un algoritmo de seguimiento de gran alcance que tiene aplicaciones a escala molecular y celular.

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Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Objetivos múltiples de seguimiento es un algoritmo desarrollado para el seguimiento de fabricación casera individualmente moléculas marcadas dentro de la membrana plasmática de las células vivas. De manera eficiente la detección, la estimación y el seguimiento de las moléculas a través del tiempo en la alta densidad proporcionan un fácil de usar, herramienta completa para investigar la dinámica de la membrana a nanoescala.

Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K vistas.  Parc scientifique de Luminy. Objetivos múltiples de seguimiento es un algoritmo desarrollado para el seguimiento de fabricación casera individualmente moléculas marcadas dentro de la membrana plasmática de las células vivas. De manera eficiente la detección, la estimación y el seguimiento de las moléculas a través del tiempo en la alta densidad proporcionan un fácil de usar, herramienta completa para investigar la dinámica de la membrana a nanoescala.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Investigación

Biología

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.