Presentamos iSCAT por primera vez en 2004 en el contexto de la detección y espectroscopia de nanopartículas de oro. En los 10 años siguientes desarrollamos esta técnica para la detección y seguimiento de nanopartículas biológicas como virus y pequeñas proteínas. La esencia de la técnica es que cualquier objeto material, por pequeño que sea, tiene una sección transversal de extinción finita.
La principal ventaja de esta técnica es la detección sin etiquetas. Esto significa que si somos lo suficientemente sensibles, podemos detectar casi cualquier cosa, como proteínas o exosomas secretados de células individuales. El problema que uno tiene que tener cuidado es cómo tratar el fondo de dispersión.
Una gran ventaja de un microscopio iSCAT es que se puede construir completamente en casa y se puede añadir a un microscopio comercial existente. Esto significa que se puede combinar fácilmente con otras técnicas ópticas, como la fluorescencia, y esta es una de las razones por las que muchos grupos también están empleando ahora iSCAT y técnicas relacionadas. Aquí utilizamos las células LUZ como un sistema modelo para mostrar la detección de proteínas individuales y secretores.
Sin embargo, este método también se puede aplicar para sondear casi cualquier proceso biológico a nivel molecular. Para lograr un microscopio estable, comience con una mesa óptica amortiguada y un bloque masivo rígido para la etapa de la muestra. Construir una etapa de muestra de microscopio que incorpore un objetivo de apertura numérica alta y una unidad de traducción que permita la traducción lateral de muestras, así como el cambio de posición de enfoque para el objetivo.
Utilice un espejo de acoplamiento vertical de 45 grados y una lente singlete de longitud focal de 50 centímetros para enfocar la luz de un láser de diodo a 445 nanómetros de longitud de onda en el plano focal posterior del objetivo. Esta lente de campo ancho crea un haz colimado en el enfoque delantero del objetivo, que se convertirá en la fuente de iluminación iSCAT. Aplique una gota de aceite de inmersión al objetivo y coloque un cubreobjetos de vidrio en el plano de muestra de la etapa del microscopio.
Esto resultará en un haz que refleja hacia abajo a través del objetivo de imagen. Para configurar la trayectoria de imagen, introduzca un juego de haces recubierto antirreflejo en un ángulo de 45 grados en relación con el haz incidente y aproximadamente 10 centímetros después de la lente de campo ancho. Asegúrese de que el recubrimiento antirreflejo apunte hacia la fuente láser.
Preste atención ya que un rayo grueso que introduce un desplazamiento de haz significativo para que el láser ya no pueda entrar en el objetivo recto. Si es necesario, realinee la trayectoria del rayo láser antes del juego de haces para garantizar la propagación correcta a través del objetivo. Para asegurarse de que el plano de muestra y la cámara son parfocales, comience colocando una lente cóncava con una distancia focal negativa de 45 centímetros en una posición cinco centímetros después de la lente de campo ancho en la trayectoria del haz incidente.
Esto dará como resultado una viga colimada que entra en la abertura posterior del objetivo. Con la pantalla colocada en el brazo reflectante del interferómetro, mueva el objetivo en la dirección vertical para encontrar la posición focal gruesa. El objetivo está enfocado cuando el haz que golpea la pantalla es colimado.
Retire tanto el objetivo de distancia focal negativa como la pantalla cuando se complete el enfoque grueso. Añade una segunda lente singlete de 50 centímetros de longitud focal para enfocar la luz dispersa y colisionar la luz reflejada. Asegúrese de que la lente se coloca a 50 centímetros del plano focal posterior del objetivo para que el rayo láser transmitido se colimato de nuevo.
Para completar el conjunto de configuración de iSCAT, coloque la cámara CMOS a 50 centímetros de distancia de la lente de distancia focal de 50 centímetros y coloque el haz directamente en el centro del chip. Para configurar canales de imagen adicionales, combine la salida de una fuente de luz LED en un objetivo de larga distancia de trabajo. Instale componentes mecánicos por encima de la cámara de muestra que permitan enfocar y posicionar lateralmente la salida LED en la muestra.
Mueva el objetivo superior lateralmente para que el objetivo de campo ancho superior y el objetivo inferior de iSCAT sean colineales. Esto se determina colocando una pantalla bajo el objetivo inferior y maximizando la intensidad de la luz LED transmitida en la pantalla. Ahora, coloque un espejo dicroico de paso corto de 550 nanómetros para dividir la luz LED transmitida de la trayectoria láser iSCAT.
Divida este haz en dos canales con un ocho por ciento reflectante, 92 por ciento transmisivo, éster de haces. La ruta del 92 por ciento es el canal de fluorescencia, y la ruta del ocho por ciento se utiliza para la imagen de campo brillante. Imbre el canal de campo brillante en una cámara CMOS utilizando una lente de doblete acromática de longitud focal de cinco centímetros.
Ijere el canal de fluorescencia en una cámara CMOS separada utilizando una lente de doblete acromática de longitud focal de cinco centímetros. Además, utilice un filtro de paso largo de 600 nanómetros para bloquear la luz de excitación. Para configurar el ordenador y el software, conecte todas las cámaras a un ordenador.
En la configuración completamente montada, observe la imagen de iSCAT en la cámara CMOS y asegúrese de que está enfocada al encontrar una partícula residual de polvo o suciedad en el cubreobjetos de vidrio. Compruebe que la imagen de la partícula es una función de dispersión de puntos circularmente simétrica. La función de propagación de puntos no tendrá una forma circular si el rayo láser entra en el objetivo del microscopio en un ángulo ligero.
Esto se puede corregir mediante un ligero ajuste del espejo de 45 grados para asegurar el acoplamiento recto en el objetivo. Compare las imágenes de la cámara de los canales brightfield y fluorescence. Asegúrese de que ambos estén enfocados y muestre la misma área mediante la toma de imágenes de un cordón fluorescente o una muestra de celda.
Compruebe que la posición del láser iSCAT está aproximadamente en el centro de la imagen y tome nota de su posición para su referencia posterior. Para cambiar la posición y el campo de visión del campo brillante y el canal de fluorescencia, mueva las cámaras de la mesa con respecto a las lentes de enfoque. Prepárese para el experimento como se detalla en el protocolo de texto.
Esto incluye la preparación de las células y el medio de microscopía, así como la cubeta de muestra del microscopio. Asegúrese de que el rayo láser esté bloqueado para evitar que las células se expongan directamente a la luz láser iSCAT. Inyecte aproximadamente tres microlitros de la muestra de celda preparada ligeramente fuera del centro en la cubeta de muestra.
Toque suavemente la punta de la pipeta en el cubreobjetos e inyecte lentamente la solución celular. Permita que las células se asienten en el cubreobjetos. Compruebe el número de celdas cercanas al láser iSCAT.
Si el número de celdas es demasiado bajo, repita este paso hasta que haya un número suficiente disponible. Si la cobertura de las células es demasiado densa, utilice una inyección de aproximadamente 20 microlitros de medio de microscopía adicional para dispersar las células a través del cubreobjetos. Con la etapa de traslación piezoeléctrica, mueva la muestra lateralmente para colocar una celda cerca del campo de visión iSCAT.
Asegúrese de que la célula no entre en el campo de visión iSCAT, ya que la exposición directa a la luz láser de 445 nanómetros podría ser perjudicial para la célula. Desbloquee el rayo láser iSCAT y asegúrese de que la superficie del cubreobjetos esté todavía enfocada. Encierra la mesa de aislamiento para minimizar la deriva y el acoplamiento acústico del entorno ambiente.
Inicie la medición adquiriendo imágenes de las cámaras iSCAT, brightfield y fluorescence. Compruebe periódicamente la viabilidad de la célula y el enfoque del sistema. Aquí, el software de microscopio auto-escrito se utiliza para mostrar las imágenes de la cámara.
Aquí, la imagen diferencial se realiza en tiempo real mediante la resta de marcos consecutivos para hacer visibles las uniones proteicas. Esto da como resultado una imagen filtrada que es visible en la pantalla junto con la imagen de cámara sin procesar. Los resultados representativos de un experimento de secreción celular llevado a cabo con iSCAT se muestran aquí.
El video muestra las secreciones de una célula LAZ en el transcurso de dos minutos. Las imágenes diferenciales iSCAT de la izquierda visualizan la absorción de proteínas individuales a la cubierta. Las imágenes de campo brillante y el canal de fluorescencia de la derecha se utilizan para monitorear la viabilidad celular.
Este histograma muestra las proteínas detectadas y su rango de contraste dentro de ese período de tiempo de dos minutos. Los datos se recopilaron mediante el análisis de eventos de enlace individuales en cada fotograma de los datos de vídeo de iSCAT mediante un algoritmo de búsqueda de picos personalizado. La microscopía ISCAT no sólo es una poderosa herramienta en la biosensación, sino también en la microscopía, ya que permite la detección sin etiquetas de nanoobjetos en tiempo real.
En particular, se puede aplicar a una variedad de procesos como la difusión y el transporte de proteínas. Debido a su exquisita sensibilidad a la dispersión de la luz, iSCAT puede detectar cualquier proteína o entidad en el campo de visión. Por supuesto, esto también significa que la técnica carece de la especificidad que aporta la fluorescencia, pero para evitar este problema, se pueden aplicar métodos adicionales como la funcionalización de la superficie para detectar proteínas específicas de interés.
No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso, y siempre se debe usar una protección ocular adecuada al ensamblar y ajustar el microscopio. La detección en tiempo real de secretomas es muy emocionante y un gran salto en el diagnóstico médico, que actualmente requiere mucho más tiempo y está muy lejos de la sensibilidad a proteínas. Todavía hay mucho espacio para mejorar el rendimiento del método y ampliar sus aplicaciones.
Así que esperamos que este video ayude a otros grupos a unirse a este emocionante esfuerzo.
