Esta técnica utiliza imágenes PET para dilucidar la distribución in vivo y la dinámica de las células B en el sistema nervioso central. Nuestro enfoque es beneficioso para el estudio de enfermedades neurológicas, donde la médula espinal afectada hace que el análisis sea más difícil. Así que hay un par de ventajas principales en nuestra técnica.
En primer lugar, hemos creado una nueva herramienta para rastrear un biomarcador de células B que nos permite capturar una serie de subconjuntos de células B y visualizarlos in vivo. En segundo lugar, nuestro método de análisis de la médula espinal permite una cuantificación altamente precisa y reproducible de las señales PET en esta región. Lo mejor de nuestra técnica es que es independiente de la enfermedad.
Se puede utilizar desde imágenes PET preclínicas hasta clínicas en cualquier escenario, donde las células B y/o la médula espinal sean de interés. De 18 a 24 horas después del radiomarcaje e inyección del anticuerpo en el ratón, prepare el ratón para la exploración aplicando gel ocular en los ojos. Asegúrese de que la cama de escaneo de cuatro ratones esté equipada con una almohadilla térmica con isoflurano configurada de 1,5 a 2 % Coloque el ratón en posición supina sobre la cama de escaneo y tire suavemente de la cola del ratón para enderezar la columna vertebral.
Una vez que el ratón esté en posición supina, péguelo firmemente con cinta adhesiva suave para microscopio sobre la cabeza y el vientre para minimizar el movimiento de la respiración. Registre la posición de escaneo de cada ratón en un cuaderno de laboratorio. Después de asegurar el primer grupo, cierre la cama y verifique la ubicación de la cama realizando una tomografía computarizada.
Haga clic en el campo de visión central de la tomografía computarizada y, una vez que la cama esté en posición, ejecute la exploración de prueba de tomografía computarizada para asegurarse de que la ubicación sea correcta. Repita hasta que la posición de la cama sea satisfactoria. Coloque una pequeña cinta blanca en la base del escáner para marcar la ubicación correcta de la cama durante el resto del estudio.
Abra el menú Controlador de movimiento y haga clic en el campo de visión central de PET para mover los ratones al anillo de PET. Una vez que la cama esté en el anillo PET, inicie la secuencia de escaneo haciendo clic en Ejecutar, y espere a que el escáner complete automáticamente la exploración PET y pase del anillo PET al CT para la adquisición de CT. Dado que la encefalomielitis autoinmune experimental, o EAE, los ratones tienen una curvatura pronunciada de la columna vertebral debido a la progresión de la enfermedad, escanearlos mientras están boca arriba ayuda a enderezar la columna vertebral.
Haz una incisión en el lado dorsal del animal y retira la piel y el pelaje para exponer la columna vertebral. Corte a lo largo de tres planos transversales a través de la columna vertebral en el cuello, directamente debajo de la caja torácica y en la parte superior de la pelvis para separar las regiones lumbar de las cervicales y torácicas. Retire con cuidado la columna vertebral segmentada para obtener dos piezas, lumbar y cervical torácica.
A continuación, aísle la columna vertebral lumbar recortando cuidadosamente la columna vertebral desde el extremo pélvico hasta que la médula espinal lumbar sea visible. Para expulsar la médula espinal lumbar, use una jeringa de punta deslizante llena de PBS y cree un sello entre la jeringa y la columna vertebral con el pulgar y el índice. Empuje suavemente el PBS a través de la jeringa para expulsar la médula espinal sobre una almohadilla absorbente, y repita para la médula espinal torácica cervical insertando la jeringa desde el lado cervical.
Coloque los tejidos de la médula espinal en un tubo de conteo gamma. Registre el peso seco y agregue PBS para asegurarse de que el tejido esté en el fondo del tubo para evitar que se seque. Coloque el tubo sobre hielo hasta que esté listo para contar.
Para comenzar el análisis de las regiones de interés en la médula espinal, abra la herramienta Región de interés 3D en el menú de navegación. En el encabezado Regiones de interés, use el signo más en la parte inferior del menú para crear seis regiones de interés, región lumbar de interés, región torácica cervical de interés, esqueleto lumbar, esqueleto torácico, médula espinal lumbar, médula espinal torácica. Para evitar la interferencia visual de la señal PET, haga clic en F3 para apagar la PET.
Ve a la parte superior del Operador de la Herramienta Región de Interés 3D, y haz clic en el punto sólido a la derecha del símbolo del cursor para abrir el Modo de Pintura 3D, y el menú Erosionar/Dilatar. Seleccione Esfera y cambie el tamaño a 20 píxeles. Del mismo modo, establezca dilatar a más cinco.
Antes de continuar, vaya a la parte inferior del menú y asegúrese de que la región lumbar de interés esté seleccionada. En la tomografía computarizada, busque la vértebra L6 de la columna vertebral. Comenzando con una vértebra por encima de L6, dibuja una región lumbar áspera de interés sobre las cinco vértebras por encima de las caderas.
A continuación, cambie a la región torácica cervical de interés y trace el resto de la columna vertebral hasta la base del cráneo. Después de dibujar las regiones de interés generalizadas, vaya a la parte superior del operador y seleccione el menú Algoritmos de segmentación. En el menú desplegable, seleccione Otsu Thresholding, luego seleccione la región lumbar de interés para la entrada y asegúrese de que el esqueleto lumbar esté elegido en la parte inferior del menú.
En el menú desplegable junto a Imagen, asegúrese de que la tomografía computarizada esté seleccionada, indicada aquí por el número cero. Haga clic en Aplicar y repita el procedimiento para la región torácica cervical de interés y el esqueleto torácico. Después de usar Otsu Thresholding para crear las regiones de esqueleto de interés, regrese al menú de navegación y elimine la región de interés, o marque la columna H para las regiones torácicas lumbar y cervical de interés para ocultarlas.
Marque la columna I para ambas regiones esqueléticas de interés, de modo que no se puedan editar. Por último, vuelva a la parte superior del operador de la herramienta Región de interés 3D y vaya al menú Pintura 3D para dibujar las regiones de interés de la médula espinal. Vuelva a seleccionar la herramienta Esfera y trace la médula espinal dentro del esqueleto tanto para la zona lumbar como para la torácica, asegurándose de seleccionar la región de interés correcta en la parte inferior del menú.
Para borrar cualquier región de interés, haga clic en Comando/Control y dibuje sobre la parte que desea borrar. Verifique la región de interés de la médula espinal desde los tres planos para asegurarse de que no se dibuje ninguna región de interés fuera de la columna vertebral. Si se desactivó la señal PET, presione F3 después de dibujar las regiones de interés de la médula espinal para volver a encender el PET, o seleccione el controlador visual y haga clic en la barra PET.
Vuelva al menú de navegación. Haga clic en el icono de cuadrícula para mostrar la tabla. Copie la tabla en un software de hoja de cálculo y guarde el archivo.
Las imágenes PET revelaron una unión elevada de radiotrazadores en el cerebro y la médula espinal torácica de los ratones EAE en comparación con los ratones naïve. El recuento gamma ex vivo mostró un aumento de la unión en los segmentos espinales torácicos lumbares y cervicales, y en el cerebro de los ratones EAE en comparación con los naïve. Las imágenes de autorradiografía ex vivo mostraron un aumento de la unión de radiotrazadores en secciones cerebrales sagitales, específicamente en el tronco encefálico, el cerebelo y los ventrículos de los ratones EAE en comparación con los ratones naïve.
Del mismo modo, se observó un aumento de la unión a radiotrazadores en los segmentos de la médula espinal cervical torácica y lumbar de los ratones EAE en comparación con la médula espinal naïve. Después de la PET y el conteo gamma, podemos investigar la relación entre la señal PET y la diana de interés a través de técnicas de biología molecular, como la citometría de flujo y la inmunohistoquímica. Nuestra técnica ha allanado el camino para que los investigadores hagan preguntas sobre el papel in vivo de las células B en múltiples áreas de enfermedades, incluidos los accidentes cerebrovasculares, la esclerosis múltiple, otras enfermedades autoinmunes y el cáncer.
