이 기술은 PET 이미징을 사용하여 중추 신경계에서 B 세포의 생체 내 분포 및 역학을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 영향을 받은 척수로 인해 분석이 더 어려워지는 신경 질환을 연구하는 데 유용합니다. 따라서 우리 기술에는 몇 가지 주요 장점이 있습니다.
먼저, 다양한 B 세포 서브셋을 캡처하고 생체 내에서 시각화할 수 있는 pan B 세포 바이오마커를 추적하는 새로운 도구를 만들었습니다. 둘째, 당사의 척수 분석 분석법은 이 부위의 PET 신호를 매우 정확하고 재현 가능한 정량화할 수 있습니다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 질병에 구애받지 않는다는 것입니다.
전임상부터 임상 PET 영상까지 B 세포 및/또는 척수가 관심 있는 모든 시나리오에서 사용할 수 있습니다. 방사선 표지를 하고 항체를 마우스에 주입한 후 18-24시간 후에 아이 젤을 눈에 도포하여 마우스가 스캔할 수 있도록 준비합니다. 4개의 마우스 스캐닝 베드에 이소플루란이 1.5%로 설정된 가열 패드가 장착되어 있는지 확인합니다.마우스를 스캐닝 베드의 누운 자세에 놓고 마우스 꼬리를 부드럽게 당겨 척추를 곧게 펴십시오.
마우스가 누운 자세가 되면 부드러운 현미경 테이프로 머리와 배에 단단히 테이프로 붙여서 호흡 동작을 최소화합니다. 실험실 노트북에 각 마우스의 스캔 위치를 기록합니다. 첫 번째 그룹을 확보한 후 침대를 닫고 CT 스캔을 실행하여 침대 배치를 확인합니다.
CT Center Field of View를 클릭하고 침대가 제자리에 있으면 CT 테스트 스캔을 실행하여 배치가 올바른지 확인합니다. 침대 위치가 만족스러울 때까지 반복합니다. 스캐너 베드에 작은 흰색 테이프를 붙여서 나머지 연구를 위한 올바른 베드 배치를 표시합니다.
모션 컨트롤러 메뉴를 열고 PET Center Field of View를 클릭하여 마우스를 PET 링으로 이동합니다. 침대가 PET 링에 있으면 실행을 클릭하여 스캔 시퀀스를 시작하고 스캐너가 PET 스캔을 자동으로 완료할 때까지 기다렸다가 CT 획득을 위해 PET 링에서 CT로 이동합니다. 실험용 자가면역 뇌척수염(EAE)은 질병 진행으로 인해 척추의 만곡이 뚜렷하기 때문에 등을 대고 스캔하면 척추를 곧게 펴는 데 도움이 됩니다.
동물의 등쪽을 절개하고 피부와 털을 제거하여 척추를 노출시킵니다. 목의 척추, 흉곽 바로 아래, 골반 상단을 통해 세 개의 횡평면을 따라 절단하여 요추와 경추 및 흉부 부위를 분리합니다. 분절된 척추를 조심스럽게 제거하여 요추와 경추 흉부의 두 조각을 얻습니다.
그런 다음 요추 척수가 보일 때까지 골반 끝에서 척추를 조심스럽게 다듬어 요추 척주를 분리합니다. 요추 척수를 배출하려면 PBS로 채워진 슬립 팁 주사기를 사용하고 엄지와 검지를 사용하여 주사기와 척추 사이에 밀봉을 만듭니다. PBS를 주사기를 통해 부드럽게 밀어 흡수 패드로 척수를 배출하고 경추 쪽에서 주사기를 삽입하여 경추 흉추 척수에 대해 반복합니다.
감마 카운팅 튜브에 척수 조직을 넣습니다. 건조 중량을 기록하고 PBS를 추가하여 조직이 튜브 바닥에 있는지 확인하여 건조를 방지합니다. 계산할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
척수의 관심 영역 분석을 시작하려면 탐색 메뉴에서 3D 관심 영역 도구를 엽니다. 관심 영역 머리글 아래에서 메뉴 하단의 더하기 기호를 사용하여 요추 관심 영역, 경추 흉부 관심 영역, 요추 골격, 흉부 골격, 요추 척수, 흉추 척수 등 6개의 관심 영역을 만듭니다. PET 신호의 시각적 간섭을 방지하려면 F3을 클릭하여 PET를 끕니다.
3D 관심 영역 도구 연산자 상단으로 이동하여 커서 기호 오른쪽에 있는 실선을 클릭하여 3D 페인트 모드 및 침식/팽창 메뉴를 엽니다. 구를 선택하고 크기를 20픽셀로 변경합니다. 마찬가지로 팽창을 더하기 5로 설정합니다.
계속 진행하기 전에 메뉴 하단으로 이동하여 요추 관심 영역이 선택되어 있는지 확인하십시오. CT에서 척추의 L6 척추를 찾습니다. L6 위의 척추 1개부터 시작하여 엉덩이 위의 5개 척추뼈 위에 대략적인 요추 관심 영역을 그립니다.
그런 다음 관심 있는 경추 흉부 영역으로 전환하고 척추의 나머지 부분을 두개골 기저부까지 추적합니다. 일반화된 관심 영역을 그린 후 연산자의 맨 위로 이동하여 Segmentation Algorithms 메뉴를 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 Otsu Thresholding을 선택한 다음 입력에 대해 요추 관심 영역을 선택하고 메뉴 하단에서 요추 골격이 선택되었는지 확인합니다.
Image(이미지) 옆의 드롭다운 메뉴에서 CT 스캔이 선택되어 있는지 확인합니다(여기에 숫자 0으로 표시됨). Apply(적용)를 클릭하고 경추 흉부 관심 영역과 흉부 골격에 대해 절차를 반복합니다. Otsu 임계값을 사용하여 골격 관심 영역을 만든 후 탐색 메뉴로 돌아가 관심 영역을 삭제하거나 거친 요추 및 경추 흉부 관심 영역 모두에 대해 H 열을 선택하여 숨깁니다.
두 스켈레탈 관심 영역에 대해 I 열을 체크 표시하여 편집할 수 없도록 합니다. 마지막으로 3D Region of Interest Tool Operator의 상단으로 돌아가 3D Paint 메뉴로 이동하여 관심 척수 영역을 그립니다. [구] 도구를 다시 선택하고 요추와 흉부의 골격 내에서 척수를 추적하여 메뉴 하단에서 올바른 관심 영역이 선택되었는지 확인합니다.
관심 영역을 지우려면 Command/Control을 클릭하고 지울 부분 위에 그립니다. 세 평면 모두에서 척수 관심 영역을 확인하여 관심 영역이 척추 외부에 그려져 있지 않은지 확인합니다. PET 신호가 꺼진 경우 척수 관심 영역을 그린 후 F3 키를 눌러 PET를 다시 켜거나 Visual Controller를 선택하고 PET 막대를 클릭합니다.
탐색 메뉴로 돌아갑니다. 그리드 아이콘을 클릭하여 테이블을 표시합니다. 테이블을 스프레드시트 소프트웨어에 복사하고 파일을 저장합니다.
PET 이미징은 순진한 쥐에 비해 EAE 쥐의 뇌와 흉부 척수에서 높은 방사성 추적자 결합을 보여주었습니다. 생체 외 감마 계수는 요추 및 경추 흉추 분절과 EAE 마우스의 뇌에서 결합이 증가했음을 보여주었습니다. 생체 외 자가방사선 촬영 이미지는 순진한 생쥐에 비해 EAE 생쥐의 시상 뇌 절편, 특히 뇌간, 소뇌 및 심실에서 방사성 추적자 결합이 증가했음을 보여주었습니다.
유사하게, 증가된 방사성 추적자 결합은 순진한 척수에 비해 EAE 마우스의 경추 흉부 및 요추 척수 세그먼트 모두에서 관찰되었습니다. PET 이미징 및 감마 카운팅 후 유세포 분석 및 면역조직화학과 같은 분자생물학 기술을 통해 PET 신호와 관심 대상 간의 관계를 조사할 수 있습니다. 우리의 기술은 연구자들이 뇌졸중, 다발성 경화증, 기타 자가면역 질환 및 암을 포함한 여러 질병 영역에서 B 세포의 생체 내 역할에 대해 질문할 수 있는 길을 열었습니다.
