PETイメージングを用いて、中枢神経系におけるB細胞のin vivo分布と動態を解明する手法です。私たちのアプローチは、脊髄が罹患しているため分析が困難になる神経疾患の研究に有益です。このように、私たちの手法にはいくつかの主な利点があります。
まず、汎B細胞バイオマーカーを追跡するための新しいツールを作成し、さまざまなB細胞サブセットを捕捉し、in vivoで可視化できるようにしました。第二に、私たちの脊髄分析法は、この領域のPET信号の高精度で再現性の高い定量を可能にします。私たちの技術の素晴らしいところは、病気にとらわれないことです。
前臨床から臨床まで、B細胞や脊髄が関心のあるあらゆるシナリオで使用できます。放射性標識を行い、抗体をマウスに注入してから18〜24時間後に、眼球ゲルを眼に塗布してマウスをスキャン用に準備します。4匹のマウススキャニングベッドに、イソフルランを1.5〜2%に設定した加熱パッドが装備されていることを確認するマウスをスキャニングベッドの仰臥位に置き、マウスの尾をそっと引いて背骨をまっすぐにします。
マウスが仰臥位になったら、頭と腹に柔らかい顕微鏡テープでしっかりとテープを貼り、呼吸による動きを最小限に抑えます。各マウスのスキャン位置を実験ノートに記録します。第1グループを確保したら、ベッドを閉じ、CTスキャンを実行してベッドの配置を確認します。
CTセンターフィールドオブビューをクリックし、ベッドが所定の位置に配置されたら、CTテストスキャンを実行して、配置が正しいことを確認します。ベッドの位置が満足のいくものになるまで繰り返します。スキャナーベッドに小さな白いテープを貼って、研究の残りの部分の正しいベッドの位置をマークします。
モーションコントローラーメニューを開き、PETセンターフィールドオブビューをクリックして、マウスをPETリングに移動します。ベッドがPETリングに入ったら、[実行]をクリックしてスキャンシーケンスを開始し、スキャナーが自動的にPETスキャンを完了するのを待ち、PETリングからCTに移動してCTを取得します。実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、病気の進行により脊椎の湾曲が顕著であるため、背中からスキャンすることで脊椎をまっすぐにすることができます。
動物の背側を切開し、皮膚と毛皮を取り除き、脊柱を露出させます。首の脊柱、胸郭の真下、骨盤の上部を通る3つの横面に沿って切断し、腰椎を頸部および胸部から分離します。セグメント化された脊柱を慎重に取り外して、腰椎と頸椎胸部の2つの部分を取得します。
次に、腰椎脊髄が見えるまで脊柱を骨盤端から慎重にトリミングすることにより、腰椎脊柱を分離します。腰椎脊髄を排出するには、PBSを充填したスリップチップシリンジを使用し、親指と人差し指を使用してシリンジと脊柱の間にシールを作成します。PBSをシリンジにそっと押し込んで脊髄を吸収パッドに排出し、シリンジを子宮頸部側から挿入して頸部胸脊髄についても繰り返します。
脊髄組織をガンマカウントチューブに入れます。乾燥重量を記録し、PBSを添加して、組織がチューブの底にあることを確認し、乾燥を防ぎます。カウントの準備ができるまでチューブを氷の上に置きます。
脊髄の関心領域の解析を開始するには、ナビゲーションメニューから 3D 関心領域ツールを開きます。[関心領域] ヘッダーで、メニューの下部にあるプラス記号を使用して、腰部関心領域、頸部胸部関心領域、腰骨格、胸骨格、腰部脊髄、胸部脊髄の 6 つの関心領域を作成します。PET信号からの視覚的な干渉を避けるために、F3をクリックしてPETをオフにします。
3D Region of Interest Tool Operatorの上部に移動し、カーソル記号の右側にある実線の点をクリックして、3Dペイントモードと侵食/拡張メニューを開きます。[球体] を選択し、サイズを 20 ピクセルに変更します。同様に、拡張をプラス 5 に設定します。
先に進む前に、メニューの下部に移動し、関心のある腰椎領域が選択されていることを確認してください。CTで、脊柱のL6椎骨を見つけます。L6より上の1つの椎骨から始めて、腰の上の5つの椎骨の上に大まかな腰椎領域を描きます。
次に、頸部胸部の関心領域に切り替え、脊椎の残りの部分を頭蓋骨の基部までトレースします。ジェネラライズされた関心領域を描画した後、演算子の上部に移動し、[セグメンテーション アルゴリズム] メニューを選択します。ドロップダウンメニューからOtsu Thresholdingを選択し、入力に腰椎の関心領域を選択し、メニューの下部で腰椎骨格が選択されていることを確認します。
[画像]の横のドロップダウンメニューで、CTスキャンが選択されていることを確認します(ここでは数字のゼロで示されています)。[適用]をクリックし、頸部胸部関心領域と胸部骨格の手順を繰り返します。Otsu Thresholdingを使用してスケルトン関心領域を作成した後、ナビゲーションメニューに戻り、関心領域を削除するか、粗い腰椎と頸部胸部の両方の関心領域のH列にチェックマークを付けて非表示にします。
両方の骨格領域の I 列にチェックマークを付け、編集できないようにします。最後に、[3D 関心領域ツール](3D Region of Interest Tool)オペレータの上部に戻り、[3D ペイント](3D Paint)メニューに移動して、脊髄の関心領域を描画します。球体ツールを再度選択し、腰椎と胸椎の両方の骨格内の脊髄をトレースし、メニューの下部で正しい関心領域が選択されていることを確認します。
関心領域を消去するには、コマンド/コントロールをクリックし、消去する部分に描画します。3 つの平面すべてから脊髄の関心領域をチェックして、関心領域が脊柱の外側に描画されていないことを確認します。PET信号がオフになっていた場合は、関心領域が描かれた後にF3を押してPETをオンに戻すか、ビジュアルコントローラーを選択してPETバーをクリックします。
ナビゲーションメニューに戻ります。グリッドアイコンをクリックしてテーブルを表示します。表を表計算ソフトにコピーし、ファイルを保存します。
PETイメージングにより、EAEマウスの脳および胸部脊髄における放射性トレーサー結合の上昇が、ナイーブマウスと比較して明らかになりました。Ex vivoガンマカウントでは、腰椎と頸部の両方の胸椎セグメント、およびEAEマウスの脳の結合がナイーブと比較して増加しました。ex vivoオートラジオグラフィー画像は、ナイーブマウスと比較して、矢状脳切片、特にEAEマウスの脳幹、小脳、および心室における放射性トレーサー結合の増加を示しました。
同様に、ナイーブ脊髄と比較して、EAEマウスの頸部胸部と腰部の両方の脊髄セグメントで放射性トレーサー結合の増加が観察されました。PETイメージングとガンマカウントの後、フローサイトメトリーや免疫組織化学などの分子生物学的手法を用いて、PETシグナルと目的のターゲットとの関係を調べることができます。私たちの技術は、脳卒中、多発性硬化症、その他の自己免疫疾患、癌など、複数の疾患領域におけるB細胞のin vivoの役割について研究者が疑問を呈する道を開きました。
