Diese Technik nutzt die PET-Bildgebung, um die In-vivo-Verteilung und -Dynamik von B-Zellen im zentralen Nervensystem aufzuklären. Unser Ansatz ist vorteilhaft für die Untersuchung neurologischer Erkrankungen, bei denen das betroffene Rückenmark die Analyse erschwert. Es gibt also ein paar Hauptvorteile unserer Technik.
Zunächst haben wir ein neues Werkzeug entwickelt, um einen Pan-B-Zell-Biomarker zu verfolgen, der es uns ermöglicht, eine Reihe von B-Zell-Untergruppen zu erfassen und in vivo zu visualisieren. Zweitens ermöglicht unsere Methode der Rückenmarksanalyse eine hochgenaue und reproduzierbare Quantifizierung von PET-Signalen in dieser Region. Das Tolle an unserer Technik ist, dass sie krankheitsunabhängig ist.
Es kann von der präklinischen bis zur klinischen PET-Bildgebung in jedem Szenario eingesetzt werden, in dem B-Zellen und/oder das Rückenmark von Interesse sind. 18 bis 24 Stunden nach der radioaktiven Markierung und Injektion des Antikörpers in die Maus bereiten Sie die Maus auf das Scannen vor, indem Sie Augengel auf die Augen auftragen. Stellen Sie sicher, dass das Scan-Bett für vier Mäuse mit einem Heizkissen ausgestattet ist, dessen Isofluran von 1,5 bis 2 % eingestellt ist. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Scan-Bett und ziehen Sie vorsichtig am Mausschwanz, um die Wirbelsäule zu begradigen.
Sobald sich die Maus in Rückenlage befindet, kleben Sie sie mit weichem Mikroskopband über Kopf und Bauch, um die Atembewegung zu minimieren. Notieren Sie sich die Scanposition für jede Maus in einem Labornotizbuch. Nachdem Sie die erste Gruppe gesichert haben, schließen Sie das Bett und überprüfen Sie die Platzierung des Bettes, indem Sie einen CT-Scan durchführen.
Klicken Sie auf CT Center View Field of View, und sobald das Bett in Position ist, führen Sie den CT-Testscan durch, um sicherzustellen, dass die Platzierung korrekt ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Bettposition zufriedenstellend ist. Legen Sie ein kleines weißes Klebeband auf das Scannerbett, um die richtige Platzierung des Bettes für den Rest der Studie zu markieren.
Öffnen Sie das Motion-Controller-Menü und klicken Sie auf PET Center Field of View, um die Mäuse in den PET-Ring zu verschieben. Sobald sich das Bett im PET-Ring befindet, starten Sie die Scansequenz, indem Sie auf Ausführen klicken, und warten Sie, bis der Scanner den PET-Scan automatisch abgeschlossen hat, und wechseln Sie vom PET-Ring zum CT für die CT-Aufnahme. Seit der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) haben Mäuse aufgrund des Fortschreitens der Krankheit eine ausgeprägte Krümmung der Wirbelsäule, das Scannen auf dem Rücken hilft, die Wirbelsäule aufzurichten.
Machen Sie einen Schnitt entlang der Rückenseite des Tieres und entfernen Sie die Haut und das Fell, um die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie entlang von drei Querebenen durch die Wirbelsäule am Hals, direkt unter dem Brustkorb und an der Oberseite des Beckens, um die Lendenwirbelsäule von den Hals- und Brustregionen zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig die segmentierte Wirbelsäule, um zwei Teile zu erhalten, eine Lendenwirbelsäule und eine Halswirbelsäule.
Isolieren Sie dann die Lendenwirbelsäule, indem Sie die Wirbelsäule vorsichtig vom Beckenende aus kürzen, bis das lumbale Rückenmark sichtbar ist. Um das lumbale Rückenmark auszustoßen, verwenden Sie eine mit PBS gefüllte Slip-Tip-Spritze und schaffen Sie mit Daumen und Zeigefinger eine Abdichtung zwischen der Spritze und der Wirbelsäule. Schieben Sie das PBS vorsichtig durch die Spritze, um das Rückenmark auf eine saugfähige Unterlage zu stoßen, und wiederholen Sie den Vorgang für das zervikale thorakale Rückenmark, indem Sie die Spritze von der zervikalen Seite aus einführen.
Legen Sie das Rückenmarksgewebe in ein Gamma-Zählröhrchen. Notieren Sie das Trockengewicht und fügen Sie PBS hinzu, um sicherzustellen, dass sich das Gewebe am Boden des Röhrchens befindet, um ein Austrocknen zu vermeiden. Lege das Röhrchen auf Eis, bis es zum Zählen bereit ist.
Um mit der Analyse von Interessenbereichen im Rückenmark zu beginnen, öffnen Sie das Werkzeug "3D-Interessenbereich" über das Menü "Navigation". Verwenden Sie unter der Überschrift "Regions of Interest" das Pluszeichen am unteren Rand des Menüs, um sechs Regions of Interest zu erstellen: Lendenwirbelsäule, zervikale Brustregion von Interesse, Lendenskelett, Brustskelett, lumbales Rückenmark, thorakales Rückenmark. Um visuelle Störungen durch das PET-Signal zu vermeiden, klicken Sie auf F3, um das PET auszuschalten.
Gehen Sie zum oberen Rand des 3D-Werkzeugoperators für die Interessenregion und klicken Sie auf den durchgezogenen Punkt rechts neben dem Cursorsymbol, um den 3D-Malmodus und das Menü Erodieren/Erweitern zu öffnen. Wählen Sie Kugel aus, und ändern Sie die Größe auf 20 Pixel. Stellen Sie die Erweiterung ebenfalls auf plus fünf ein.
Bevor Sie fortfahren, gehen Sie zum Ende des Menüs und stellen Sie sicher, dass der gewünschte Lendenwirbelbereich ausgewählt ist. Auf dem CT finden Sie den L6-Wirbel der Wirbelsäule. Beginnen Sie mit einem Wirbel oberhalb von L6 und zeichnen Sie eine grobe Lendenwirbelregion über die fünf Wirbel über den Hüften.
Wechseln Sie dann zur zervikalen Brustregion und verfolgen Sie den Rest der Wirbelsäule bis zur Schädelbasis. Nachdem Sie die generalisierten Interessenbereiche gezeichnet haben, gehen Sie zum Anfang des Operators und wählen Sie das Menü Segmentierungsalgorithmen aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Otsu-Schwellenwert aus, wählen Sie dann die interessierende Lendenwirbelsäule für die Eingabe aus und stellen Sie sicher, dass unten im Menü das Lendenskelett ausgewählt ist.
Vergewissern Sie sich, dass im Dropdown-Menü neben Bild der CT-Scan ausgewählt ist, der hier durch die Zahl Null gekennzeichnet ist. Klicken Sie auf Anwenden und wiederholen Sie den Vorgang für die zervikale Brustregion und das Brustskelett. Nachdem Sie die Otsu-Schwellenwerte verwendet haben, um die interessierenden Skelettbereiche zu erstellen, kehren Sie zum Navigationsmenü zurück, und löschen Sie den Interessenbereich, oder aktivieren Sie die Spalte H für die groben lumbalen und zervikalen Brustregionen, um sie auszublenden.
Aktivieren Sie die Spalte I für beide Skelettbereiche von Interesse, damit sie nicht bearbeitet werden können. Kehren Sie abschließend zum Anfang des 3D-Bereich-of-Interest-Tool-Operators zurück, und wechseln Sie zum Menü 3D-Malen, um die relevanten Rückenmarksregionen zu zeichnen. Wählen Sie das Kugelwerkzeug erneut aus und zeichnen Sie das Rückenmark innerhalb des Skeletts sowohl für die Lendenwirbelsäule als auch für den Brustkorb nach, wobei Sie sicherstellen müssen, dass die richtige Region von Interesse am unteren Rand des Menüs ausgewählt ist.
Um einen gewünschten Bereich zu löschen, klicken Sie auf Befehl/Strg und zeichnen Sie über den zu löschenden Teil. Überprüfen Sie die interessierende Rückenmarksregion aus allen drei Ebenen, um sicherzustellen, dass keine interessierende Region außerhalb der Wirbelsäule gezeichnet wird. Wenn das PET-Signal ausgeschaltet wurde, drücken Sie F3, nachdem die relevanten Rückenmarksregionen gezeichnet wurden, um die PET wieder einzuschalten, oder wählen Sie den visuellen Controller aus, und klicken Sie auf die PET-Leiste.
Kehren Sie zum Navigationsmenü zurück. Klicken Sie auf das Rastersymbol, um die Tabelle anzuzeigen. Kopieren Sie die Tabelle in eine Tabellenkalkulationssoftware und speichern Sie die Datei.
Die PET-Bildgebung zeigte eine erhöhte Radiotracer-Bindung im Gehirn und im thorakalen Rückenmark von EAE-Mäusen im Vergleich zu den naiven Mäusen. Die Ex-vivo-Gammazählung zeigte eine erhöhte Bindung sowohl in den lumbalen als auch in den zervikalen thorakalen Wirbelsäulensegmenten und im Gehirn von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen. Ex-vivo-Autoradiographie-Aufnahmen zeigten eine erhöhte Radiotracerbindung in sagittalen Hirnschnitten, insbesondere im Hirnstamm, Kleinhirn und in den Ventrikeln von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen.
In ähnlicher Weise wurde eine erhöhte Radiotracerbindung sowohl in den zervikalen thorakalen als auch in den lumbalen Rückenmarksegmenten von EAE-Mäusen im Vergleich zu naivem Rückenmark beobachtet. Nach der PET-Bildgebung und der Gamma-Zählung können wir die Beziehung zwischen dem PET-Signal und dem interessierenden Ziel durch molekularbiologische Techniken wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie untersuchen. Unsere Technik hat Forschern den Weg geebnet, Fragen zur In-vivo-Rolle von B-Zellen in verschiedenen Krankheitsbereichen zu stellen, darunter Schlaganfall, Multiple Sklerose, andere Autoimmunerkrankungen und Krebs.
