Nuestro protocolo es fácil de usar. Usando esta técnica, cualquier persona puede aislar fácilmente el componente de la sangre. La contaminación se puede minimizar y los materiales se pueden separar con precisión.
Con la automatización y el establecimiento de este protocolo, los investigadores pueden obtener fácilmente sustancias relacionadas con el cáncer con alta pureza, lo que es útil para varios estudios posteriores. En particular, se espera que proporcione importantes ventajas para la investigación del usuario final. Demostrando su procedimiento estará Jay Jeong, investigador principal y gerente asistente del Instituto de Investigación Genómica del Cáncer.
Para comenzar, cargue el cartucho LBx 1 seleccionando el tipo de cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Pulse el botón de flecha para cambiar el número de muestras. Luego, abra la puerta del instrumento e inserte todos los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho.
Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón de ejecución en la pantalla del panel táctil.
El instrumento cierra las válvulas de los cartuchos, lo que tarda aproximadamente 30 segundos. Siga el mensaje para abrir la puerta. Retire la rueda de soporte y retire el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho.
Pipetear un máximo de 10 mililitros de una muestra de sangre entera utilizando una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre. Después de insertar los cartuchos en el instrumento, cierre la puerta del instrumento y pulse el botón OK.
El plasma y las capas leucocitarias se separan automáticamente de la sangre total, lo que tarda aproximadamente 30 minutos. Una vez separados el plasma y la capa leucocitaria, aparecerá un mensaje en pantalla acompañado de un sonido de alarma. Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón de parada.
Abre la puerta. Retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa. Recupere tres mililitros de plasma de la salida de plasma utilizando una punta de pipeta de un mililitro.
A continuación, recupera tres mililitros de la capa leucocitaria de la salida de la capa leucocitaria con una punta de pipeta de un mililitro. A continuación, cargue el cartucho LBx 2 seleccionando el nombre del cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Pulse el botón de flecha para cambiar el número de muestras y siga el mismo procedimiento que se muestra para que el cartucho LBx 1 inserte el cartucho en el soporte del cartucho.
Después de insertar el cartucho y cerrar la puerta, presione el botón de ejecución en la pantalla del panel táctil. Siga el procedimiento indicado anteriormente para extraer el cartucho con válvula cerrada del soporte del cartucho y colocarlo sobre la mesa. Pipetear la solución de gradiente de densidad utilizando una pipeta serológica.
Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada del cartucho e inyecte lentamente la solución. Luego, pipetear la muestra de sangre entera e inyectarla lentamente en la entrada de muestra. Después de insertar y asegurar el cartucho, cierre la puerta y pulse el botón OK.
Una vez que el plasma y PBMC se separan automáticamente de la sangre total, aparecerá un mensaje acompañado de un sonido de alarma. Abra la puerta y retire el cartucho. Recupere tres mililitros de plasma de la salida de plasma usando una punta de pipeta de un mililitro, y luego, recupere tres mililitros de PBMC de la salida de PBMC.
Del mismo modo, para el cartucho FAST-auto, después de retirar el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho, inyecte seis mililitros de la solución de PBS en la entrada de PBS del cartucho. A continuación, pipetear tres mililitros de sangre entera o capa leucocitaria obtenida de LBx 1, o muestra PBMC obtenida de LBx 2, e inyectar lentamente la muestra en la entrada de muestras del cartucho. Después de insertar el cartucho y asegurarlo, cierre la puerta y pulse el botón OK.
Una vez que se complete el enriquecimiento automático de CTC, detenga la alarma. Retire el cartucho e inserte el removedor de placa posterior, o BPR, en los cuatro orificios de la parte frontal del cartucho. Presione el ala azul oscuro con los pulgares de ambas manos y luego, presione el cuerpo azul claro hasta que haga clic.
Retire con cuidado el cuerpo del cartucho levantándolo. Muy suavemente, levante la membrana del filtro por el borde con una pinza y coloque la membrana en un tubo de 1.5 mililitros para la preparación de ácido nucleico, o en un vidrio deslizante para la tinción. Si es necesario, recupere la sangre filtrada a la salida de sangre con una punta de pipeta de un mililitro.
Los cfDNAs extraídos se evaluaron utilizando Bioanalyzer, y se utilizaron cintas de cribado de cfDNA junto con una escalera electrónica. La línea verde se utilizó para alinear la escalera y la muestra. Las marcas triangulares indican la banda de ADN.
La mayoría del cfDNA tiene una longitud de 166 pares de bases y algunos existen en múltiplos enteros de longitud. Por lo general, la concentración de cfDNA mide hasta el tamaño de 50 a 700 pares de bases. Aunque hay una diferencia en la cantidad obtenida de cada muestra individual, como 8,47 nanogramos por mililitro y 5,2 nanogramos por mililitro, los resultados de la extracción de cfDNA fueron buenos tanto para la concentración como para la distribución del tamaño en todos los casos.
Estos resultados indican que el método LBx 1 separa con precisión el plasma que contiene cfDNA. En FAST-auto, la membrana se retiró y se tiñó con anticuerpos fluorescentes para detectar CTC y glóbulos blancos. La membrana teñida, colocada sobre portaobjetos de vidrio, se observó bajo un microscopio de fluorescencia.
Después de la tinción de membrana, las células muestran señales DAPI o positivas nucleares en azul, mientras que EpCAM y CK o CTC positivas se resaltan en verde, y CD45 o WBC positivo se resaltan en rojo. No es difícil quitar la membrana. Sin embargo, es necesario tener cuidado con la pérdida y contaminación de CTC.
Sangre entera, PBMC y pelaje leucocitario están disponibles. En su lugar, solo necesita configurar todo el volumen. También se pueden usar otros líquidos, aunque se requerirán pruebas.
Esta técnica se puede operar directamente en los hospitales y la sustancia se puede obtener rápidamente.
