Наш протокол удобен для пользователя. Используя эту методику, любой желающий может легко выделить компонент из крови. Загрязнение может быть сведено к минимуму, а материалы могут быть точно разделены.
Благодаря автоматизации и созданию этого протокола исследователи могут легко получать связанные с раком вещества с высокой чистотой, что полезно для различных последующих исследований. В частности, ожидается, что он обеспечит важные преимущества для исследований конечных пользователей. Демонстрировать свою процедуру будет Джей Чжон, старший научный сотрудник и помощник менеджера в Научно-исследовательском институте геномики рака.
Для начала загрузите картридж LBx 1, выбрав тип картриджа на сенсорной панели прибора. Нажмите кнопку со стрелкой, чтобы изменить количество образцов. Затем откройте дверцу прибора и вставьте все картриджи, которые будут использоваться, в порядке количества на держателе картриджа.
В общей сложности четыре картриджа поместите фиктивный картридж в пустое пространство держателя картриджа. Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Закройте дверь и нажмите кнопку «Выполнить» на экране сенсорной панели.
Прибор закрывает клапаны на картриджах, что занимает примерно 30 секунд. Следуйте сообщению, чтобы открыть дверь. Снимите опорное колесо и извлеките закрытый клапан картриджа из держателя картриджа.
Пипетка максимум 10 миллилитров образца цельной крови с использованием серологической пипетки. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите образец цельной крови. После вставки картриджей в прибор закройте дверцу прибора и нажмите кнопку OK.
Плазма и пушистые оболочки автоматически отделяются от цельной крови, что занимает примерно 30 минут. Как только плазменное и пышное пальто будут разделены, на экране появится сообщение, сопровождаемое звуком тревоги. Остановите сигнал тревоги, открыв дверь или нажав кнопку остановки.
Откройте дверь. Извлеките картридж и положите его на стол. Извлеките три миллилитра плазмы из плазменного выхода с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки.
Затем извлеките три миллилитра пальто баффи из выходного отверстия для пальто, используя наконечник пипетки в один миллилитр. Затем загрузите картридж LBx 2, выбрав имя картриджа на сенсорной панели прибора. Нажмите кнопку стрелки, чтобы изменить количество образцов, и следуйте той же процедуре, что и для картриджа LBx 1, чтобы вставить картридж в держатель картриджа.
После вставки картриджа и закрытия дверцы нажмите кнопку «Выполнить» на экране тачпада. Следуйте процедуре, показанной выше, чтобы извлечь закрытый клапан картриджа из держателя картриджа и поместить его на стол. Пипетка градиентного раствора плотности с помощью серологической пипетки.
Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите раствор. Затем пипетка образца цельной крови и медленно вводит его во входное отверстие образца. После вставки и закрепления картриджа закройте дверцу и нажмите кнопку OK.
Как только плазма и PBMC автоматически отделяются от цельной крови, появляется сообщение, сопровождаемое звуком тревоги. Откройте дверцу и извлеките картридж. Извлеките три миллилитра плазмы из плазменного выхода с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки, а затем извлеките три миллилитра PBMC из выходного отверстия PBMC.
Аналогичным образом, для картриджа FAST-auto после извлечения закрытого клапаном картриджа из держателя картриджа впрыскивайте шесть миллилитров раствора PBS во входное отверстие PBS картриджа. Затем пипетку из трех миллилитров цельной крови или пышной оболочки, полученной из LBx 1, или образца PBMC, полученного из LBx 2, и медленно вводят образец во входное отверстие образца картриджа. Вставив картридж и закрепив его, закройте дверцу и нажмите кнопку OK.
Как только автоматическое обогащение CTC будет завершено, остановите сигнализацию. Извлеките картридж и вставьте средство для удаления задней панели, или BPR, в четыре отверстия на передней панели картриджа. Нажмите на темно-синее крыло большими пальцами обеих рук, а затем нажмите на светло-голубое тело, пока оно не щелкнет.
Осторожно извлеките корпус картриджа, подняв его. Очень осторожно подберите фильтрующую мембрану за край с помощью пинцета и поместите мембрану в 1,5-миллилитровую трубку для приготовления нуклеиновой кислоты или на скользящее стекло для окрашивания. При необходимости восстановите отфильтрованную кровь к выходу крови с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки.
Извлеченные cfDNAs оценивали с помощью биоанализатора, а экранные ленты cfDNA использовали вместе с электронной лестницей. Зеленая линия использовалась для выравнивания лестницы и образца. Треугольные знаки указывают на полосу ДНК.
Большинство cfDNA имеет длину 166 пар оснований, а некоторые существуют в целочисленных кратных длине. Обычно концентрация cfDNA измеряется размером от 50 до 700 пар оснований. Хотя существует разница в количестве, полученном из каждого отдельного образца, например, 8,47 нанограмма на миллилитр и 5,2 нанограмма на миллилитр, результаты экстракции cfDNA были хорошими как для концентрации, так и для распределения по размерам во всех случаях.
Эти результаты указывают на то, что метод LBx 1 точно разделяет плазму, содержащую cfDNA. В FAST-auto мембрану удаляли и окрашивали флуоресцентными антителами для обнаружения ЦОК и лейкоцитов. Витражная мембрана, размещенная на стеклянных слайдах, наблюдалась под флуоресцентным микроскопом.
После окрашивания мембран клетки показывают DAPI или ядерно-положительные сигналы синим цветом, в то время как EpCAM и CK или CTC положительные выделены зеленым цветом, а CD45 или WBC положительные выделены красным. Удалить мембрану не составляет труда. Тем не менее, необходимо быть осторожным с потерей и загрязнением CTC.
Цельная кровь, PBMC и пышная шерсть доступны. Вместо этого вам просто нужно установить весь объем. Другие жидкости также могут быть использованы, хотя потребуется тестирование.
Этот метод может быть прооперирован непосредственно в больницах, и вещество может быть получено быстро.
