Este método permite estudiar formaciones de complejos proteicos que requieren coexpresión para muestras de prueba eficientes, como la formación de heterodímeros. El principal potencial final de este método es explotar la coexpresión de proteínas estudiadas marcadas diferencialmente utilizando combinaciones de vectores compatibles para promover un ensamblaje complejo eficiente, junto con un flujo de trabajo eficiente y escalabilidad que permita pruebas rápidas de parches de múltiples interacciones. Este método también se puede utilizar para la detección rápida de la expresión óptima de proteínas y las condiciones de purificación.
La demostración visual ayuda a realizar correctamente los pasos críticos del protocolo, como la configuración de la coexpresión, la interrupción de la celda y los pasos desplegables posteriores. Para comenzar, cultive la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) en medios Luria-Bertani, o LB, a 37 grados centígrados a una densidad óptica, u OD, de 0.1 a 0.2. Centrifugar un mililitro de la suspensión bacteriana durante un minuto a 9, 000 G a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Luego, agregue 0.5 mililitros de tampón de transformación helada, o TB, e incube durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, centrifugar durante 30 segundos a 8, 000 G a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de TB, 100 nanogramos de cada vector e incube durante 30 minutos en hielo.
Calentar a 42 grados centígrados durante 150 segundos, luego enfriar en hielo durante un minuto. A continuación, agregue un mililitro de medios LB sin antibióticos e incube a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la incubación, centrifugar y resuspender el pellet en 100 microlitros de medios LB antes de colocar la suspensión en una placa de agar LB que contenga 0,5% de glucosa y los antibióticos correspondientes.
Incubar el plato durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las células de la placa con dos mililitros de medios LB en 50 mililitros de medios LB con los antibióticos correspondientes. Agregue iones metálicos u otros cofactores conocidos antes de almacenar una alícuota con 20% de glicerol a menos 70 grados centígrados para experimentos posteriores.
Haga crecer las células con una rotación constante de 220 RPM a 37 grados centígrados a un OD de 0.5 a 0.7. Enfriar el cultivo a temperatura ambiente y añadir IPTG a una concentración final de un milimol. Almacenar una alícuota de 20 microlitros de suspensión celular como control de la muestra no inducida.
Incubar las células durante la noche a 220 RPM a 18 grados centígrados. Al día siguiente, divida la suspensión bacteriana en dos partes y almacene alícuotas de 20 microlitros para confirmar la expresión de proteínas. Centrifugar la suspensión celular restante a 4, 000 G durante 15 minutos.
Para el ensayo de extracción, resuspenda los gránulos en un mililitro de tampón de lisis helada con inhibidores de la proteasa y agentes reductores agregados inmediatamente antes del experimento. Ajuste la composición tampón para las proteínas probadas. Interrumpir las células por sonicación en hielo y almacenar una alícuota de 20 microlitros para electroforesis.
Centrifugar a 16, 000 G durante 30 minutos y recoger 20 microlitros del lisado clarificado para la electroforesis. Equilibre la resina con un mililitro de tampón de lisis helado durante 10 minutos, luego centrifugar a 2, 000 G durante 30 segundos y desechar el sobrenadante. Añadir lisados celulares a la resina e incubar durante 10 minutos a una rotación constante de 15 RPM.
Luego, centrifugar y desechar el sobrenadante antes de recolectar 20 microlitros de la fracción no unida para su análisis. A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado helado e incube durante un minuto. Nuevamente, centrifugar y desechar el sobrenadante.
Luego, realice dos lavados largos con tampón de lavado helado. Después del segundo lavado, eluya las proteínas unidas con 50 microlitros del tampón de elución en un agitador a 1, 200 RPM a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Analizar las proteínas eluyentes con electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
Aquí se muestran estudios del dominio asociado a los dedos de zinc, o ZAD, homo-dimerización en proteína de unión a maltosa, o MBP, y ensayos de pulldown de 6xHistidina. La coexpresión de MBP y TIORREDOXINA 6xHistidine-fused ZADs muestra una actividad de homodimerización buena y reproducible, apareciendo como una banda adicional en los resultados de SDS-PAGE del ensayo pulldown MBP. Aquí se muestra otro ejemplo del uso del método para estudiar la formación compleja alternativa.
En el ensayo de coexpresión, 6xHistidina-tagged ENY2 interactuó tanto con GST-tagged Sgf11 como MBP-CTCF, pero no GST-Sgf11 estaba presente en los desplegables MBP y viceversa. Aquí se muestra una comparación paso a paso de los intervalos de tiempo requeridos en el flujo de trabajo del ensayo pulldown convencional en comparación con el pulldown acoplado a la coexpresión. Aquí se muestran los resultados de la utilización de ambas técnicas para estudiar la misma interacción entre el dominio BTB de la proteína CP190 y el dominio C-terminal marcado con GST de la proteína CTCF de Drosophila.
La elección correcta de la prueba de afinidad y solubilidad, tiorredoxina, GST o MBP, es fundamental para la ejecución eficiente del ensayo. Otro paso crítico es la interrupción celular rápida y uniforme. Se recomienda encarecidamente utilizar sondas sonicadoras de múltiples puntas.
Este método permite el estudio directo de la formación de heterodímeros entre dominios proteicos que de otro modo forman homodímeros que no se disociarían durante la incubación de proteínas purificadas en el ensayo de pulldown convencional.
