Этот метод позволяет исследовать образования белковых комплексов, требующих коэкспрессии для эффективных тестовых образцов, таких как образование гетеродимеров. Основным конечным потенциалом этого метода является использование совместной экспрессии дифференциально меченных изученных белков с использованием комбинаций совместимых векторов для обеспечения эффективной сложной сборки, наряду с эффективным рабочим процессом и масштабируемостью, позволяющими быстро тестировать множественные взаимодействия. Этот метод также может быть использован для быстрого скрининга оптимальной экспрессии белка и условий очистки.
Визуальная демонстрация помогает правильно выполнять критические шаги протокола, такие как настройка коэкспрессии, разрушение клеток и последующие шаги вытягивания. Для начала выращивайте штамм Escherichia coli BL21 (DE3) в среде Лурия-Бертани или LB при температуре 37 градусов Цельсия до оптической плотности или OD от 0,1 до 0,2. Центрифугируйте один миллилитр бактериальной суспензии в течение одной минуты при температуре 9 000 г при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Затем добавьте 0,5 миллилитра ледяного буфера трансформации, или TB, и выдержите 10 минут на льду. В конце инкубации центрифугу в течение 30 секунд при 8 000 G при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 100 микролитров буфера TB, по 100 нанограммов каждого вектора, и выдержите 30 минут на льду.
Нагрейте до 42 градусов по Цельсию в течение 150 секунд, затем охладите на льду в течение одной минуты. Затем добавьте один миллилитр среды LB без антибиотиков и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут. После инкубации центрифугируют и ресуспендируют гранулы в 100 микролитрах среды LB перед нанесением суспензии на агаровую пластину LB, содержащую 0,5% глюкозы и соответствующие антибиотики.
Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день промойте клетки из пластины двумя миллилитрами среды LB в 50 миллилитров среды LB с соответствующими антибиотиками. Добавьте ионы металлов или другие известные кофакторы перед хранением аликвоты с 20% глицерином при температуре минус 70 градусов по Цельсию для последующих экспериментов.
Выращивайте клетки с постоянным вращением 220 об / мин при 37 градусах Цельсия до OD от 0,5 до 0,7. Охладите культуру до комнатной температуры и добавьте IPTG до конечной концентрации в один миллимоль. Храните 20-микролитровую аликвоту клеточной суспензии в качестве контроля неиндуцированного образца.
Инкубируйте клетки в течение ночи при 220 оборотах в минуту при 18 градусах Цельсия. На следующий день разделите бактериальную суспензию на две части и храните аликвоты объемом 20 микролитров для подтверждения экспрессии белка. Центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию в дозе 4 000 г в течение 15 мин.
Для анализа вытягивания ресуспендируют гранулы в одном миллилитре ледяного буфера лизиса с ингибиторами протеазы и восстановителями, добавленными непосредственно перед экспериментом. Отрегулируйте состав буфера для тестируемых белков. Разрушайте клетки путем обработки ультразвуком на льду и храните аликвоту объемом 20 микролитров для электрофореза.
Центрифугу по 16 000 г в течение 30 минут и собирают 20 микролитров осветленного лизата для электрофореза. Уравновесьте смолу одним миллилитром ледяного буфера для лизиса в течение 10 минут, затем центрифугу при 2 000 г в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте клеточные лизаты в смолу и выдерживайте в течение 10 минут при постоянном вращении 15 об / мин.
Затем центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость перед сбором 20 микролитров несвязанной фракции для анализа. Затем добавьте один миллилитр ледяного буфера для стирки и выдерживайте в течение одной минуты. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
Затем выполните две длительные стирки ледяным буфером для стирки. После второй промывки разбавьте связанные белки 50 микролитрами буфера для элюирования в шейкере при 1 200 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Анализируйте элюированные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS.
Здесь показаны исследования домена, связанного с цинковым пальцем, или ZAD, гомодимеризации в мальтозосвязывающем белке, или MBP, и анализов 6x-гистидинового вытягивания. Совместная экспрессия MBP и тиоредоксина 6x-гистидин-слитых ZAD демонстрирует хорошую и воспроизводимую гомодимеризационную активность, появляясь в качестве дополнительной полосы в результатах SDS-PAGE анализа вытягивания MBP. Еще один пример использования метода для изучения альтернативного комплексообразования показан здесь.
В анализе совместной экспрессии ENY2, помеченный 6xгистидином, взаимодействовал как с GST-меченным Sgf11, так и с MBP-CTCF, но GST-Sgf11 не присутствовал в выпадениях MBP и наоборот. Здесь показано пошаговое сравнение требуемых временных интервалов в рабочем процессе обычного анализа вытягивания по сравнению с вытягиванием, связанным с коэкспрессией. Здесь показаны результаты использования обоих методов для изучения одного и того же взаимодействия между доменом BTB белка CP190 и помеченным GST C-концевым доменом белка Drosophila CTCF.
Правильный выбор теста на аффинность и растворимость, тиоредоксина, GST или MBP, имеет решающее значение для эффективного выполнения анализа. Еще одним важным шагом является быстрое и равномерное разрушение клеток. Настоятельно рекомендуется использовать ультразвуковые зонды с несколькими наконечниками.
Этот метод позволяет непосредственно изучать образование гетеродимера между белковыми доменами, которые в противном случае образуют гомодимеры, которые не диссоциировали бы во время инкубации очищенных белков в обычном анализе вытягивания.
