Como una gran cantidad de terapias innovadoras están siendo investigadas para tratar el dolor crónico, nuestro protocolo proporciona conceptos cruciales para la estandarización de las cirugías necesarias para inducir dolor neuropático. La ligadura parcial del nervio ciático, o PSNL, es un modelo ventajoso para estudiar el dolor neuropático, ya que reproduce muchos síntomas observados en humanos con dolor neuropático. Como PSNL reproduce muchos síntomas observados en humanos con dolor neuropático, este protocolo proporciona conceptos cruciales para estudiar y desarrollar nuevas terapias de manejo del dolor.
Demostrando el procedimiento estará Kevin Cheng, un candidato a doctorado en MD en mi laboratorio. Para comenzar, habitúe a los ratones al aparato de prueba de Von Frey durante una hora antes de la prueba colocándolos en cajas de plexiglás transparente en una malla de alambre en la misma habitación que la sala de pruebas. Aplicar una serie de monofilamentos finos calibrados perpendicularmente a la superficie de la maceta de la pata trasera ipsilateral PSNL de los animales mantenidos en jaulas de malla de alambre suspendidas.
Determine el umbral de retirada aumentando o disminuyendo secuencialmente la fuerza de estímulo correspondiente al tamaño del filamento. Aumentar el tamaño del filamento cuando la respuesta es negativa y disminuir el tamaño del filamento cuando el animal retira su pata. Informe las respuestas negativas y positivas en la hoja de datos y pruebe la misma pata cuatro veces con diferentes filamentos después de la primera respuesta positiva.
Habitúe a los ratones al aparato de prueba Hargreaves durante una hora antes de la prueba colocándolos en cajas de plexiglás transparentes en la misma habitación que la sala de pruebas. Establezca las latencias de extracción de la pata de referencia utilizando el aparato Hargreaves. Enfoque una fuente de calor radiante en la superficie de la maceta de la pata trasera ipsilateral al PSNL y comience la estimulación.
Cuando el animal retire su pata, espere a que un detector de movimiento detenga el estímulo y detenga el temporizador. Ajuste la intensidad de la fuente de calor para obtener una línea de base de latencia de extracción de la pata de aproximadamente 10 segundos. A continuación, registre el tiempo de retiro en una tabla.
Ajuste la placa caliente a 52 grados centígrados. Coloque al animal en la cámara de prueba y encienda un cronómetro. Observe los comportamientos nocifensivos y detenga el cronómetro tan pronto como se observe el comportamiento nocifensivo.
Luego retire al animal de la cámara y registre la latencia de este comportamiento. Asegúrese de limpiar el aparato de cualquier orina entre cada animal probado para evitar afectar la temperatura del estímulo de calor. Limpie la cámara de prueba con etanol al 70% entre animales para reducir el impacto conductual de los olores.
Para hacer un gancho de vidrio nervioso, encienda el mechero bunsen. Sostenga un extremo de la varilla de vidrio al fuego en una mano. A medida que esta varilla de vidrio se derrite, use otra varilla de vidrio en la otra mano para guiar y tirar del vidrio derretido en la primera varilla.
Retire la primera varilla de vidrio del fuego y permita que el extremo de la porción derretida ruede naturalmente hacia adentro para formar una pequeña forma de bola usando la segunda varilla de vidrio. Pellizque los dedos de los pies en una pata trasera con pinzas para asegurar la ausencia de reflejo de la pata y verifique el reflejo de parpadeo corneal antes de aplicar ungüento oftálmico lubricante. Al elegir en qué lado realizar la cirugía, moldee la pata trasera del animal alrededor de la región del muslo, inferiormente hacia la rótula, superiormente hacia la cadera y por encima del fémur.
A continuación, limpie tres veces con clorhexidina en una dirección con tres gasas separadas alternadas con solución salina estéril tibia. Luego deslice la pierna a través de una hendidura hecha en una cortina estéril de 10 por 10 centímetros para crear un campo estéril alrededor de la pierna de elección. Usando tijeras quirúrgicas finas haga un pequeño corte de dos milímetros de la piel en la línea media de la cara lateral del muslo.
Deslice las tijeras debajo de la piel en un movimiento circular para romper a través de la fascia y crear un espacio libre, ampliando el espacio de la incisión. A continuación, el uso de pinzas de atado crea una incisión aguda de un centímetro de profundidad verticalmente en un ángulo de 90 grados en los músculos del muslo. Luego inserte las tijeras pequeñas y finas en la misma incisión también en un ángulo de 90 grados y ábralas suavemente para separar los músculos hasta que se visualice el nervio ciático.
Localice el nervio ciático que corre paralelo al muslo vertical en la dirección de la cadera hacia la rodilla. Retire las tijeras en las pinzas de atar del cuerpo antes de continuar. Use las pinzas extra finas en el gancho del vidrio nervioso para aislar el nervio desde abajo.
Libere cuidadosamente los nervios de los tejidos conectivos circundantes en un sitio cerca del trocánter del fémur que está más cerca de la cadera y más alejado de la rodilla. Permita que el nervio descanse sobre la varilla de vidrio y asegúrese de que el extremo de la varilla evite que el nervio se desprenda. Coloque un nudo quirúrgico para atar un tercio del ancho del nervio ciático usando una sutura de nylon de nueve cero antes de que se divida en las ramas comunes del nervio peroneo, tibial y sural.
Deslice con cuidado el nervio de la varilla de vidrio una vez que el nudo esté completo y vuelva a colocarlo en la ubicación original al nivel debajo de los músculos separados. A continuación, suture la incisión muscular con una sutura poliglicólica absorbible de cinco ceros. Por separado, suturar la piel utilizando una sutura de seis ceros de polipropileno no absorbible.
Luego registre el tiempo de parada de la cirugía y la anestesia. Permita que el ratón se despierte solo en una jaula de recuperación antes de devolverlo a una nueva jaula limpia. Utilice la prueba de Von Frey, Hargreaves o placa caliente para evaluar la hipersensibilidad térmica y mecánica y su posible reversión.
Los ratones que se sometieron a cirugía PSNL demostraron umbrales más bajos para los estímulos mecánicos en comparación con los animales simulados durante 28 días. Se obtuvieron resultados similares con la evaluación de hipersensibilidad térmica. Las latencias de extracción de la pata después de la exposición al estímulo de calor radiante aumentaron en los animales PSNL, así como las latencias de abstinencia cuando los animales se colocaron en una placa de 52 grados centígrados.
Los grupos inyectados con dos dosis diferentes de morfina mostraron una reversión de la hipersensibilidad que duró de una a dos horas. La hipersensibilidad mecánica volvió a la línea de base cuatro horas después de la inyección de morfina. Cuando se administraron dos dosis diferentes de ibuprofeno por vía intraperitoneal a los ratones, los resultados demostraron una disminución de la hipersensibilidad mecánica en comparación con los ratones inyectados con solución salina.
Limitar el daño adicional al nervio es esencial, ya que puede afectar los umbrales sensoriales del dolor. El experimentador debe prestar especial atención y usar el gancho de vidrio para reducir el daño no intencional Después de este procedimiento, este modelo de dolor neuropático crónico se puede utilizar para identificar y caracterizar el efecto antinociceptivo de los fármacos que conducen al desarrollo de nuevas terapias para el manejo del dolor.
