Esta técnica puede identificar eficientemente el genotipo S e identificar con precisión la autoincompatibilidad de los cítricos, proporcionando la información necesaria para seleccionar árboles polinizadores adecuados. Esta es una técnica eficiente en el tiempo, simple y confiable para seleccionar los árboles parentales apropiados en los programas de reproducción. Esta técnica es simple y fácil de hacer y hacer experimentos por primera vez necesita paciencia y cuidado.
La identificación del genotipo S y el diseño del cebador específico S necesitan más atención y cuidado. Demostrando el procedimiento estará Yu Hu, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience la recolección de polen llevando las flores Majia pomelo, Citrus maxima, al laboratorio.
Recoja las anteras con pinzas y colóquelas en una placa de Petri que contenga papel de filtro. Seque los granos de polen colocando la placa de Petri que contiene las anteras en un horno de 28 grados centígrados durante 24 horas. Después del secado, guarde el polen en una bolsa hermética con cierre hermético Micro Centron que contenga gel de sílice que cambia de color.
Cierre la bolsa y etiquétela con el nombre de la variedad de polen y la fecha de almacenamiento. Vierta 300 microlitros del medio líquido en la tapa de un tubo de centrífuga de dos mililitros y rocíe el polen uniformemente con la ayuda de un cepillo de polinización. Coloque el polen en una caja negra humidificada e incube a 28 grados centígrados durante 12 horas.
Después de la incubación, corte la punta superior de un milímetro de una punta de pipeta de 1.000 microlitros y aspire el polen con una pequeña cantidad de solución de cultivo. Coloque el polen en el centro del portaobjetos del microscopio y cúbralo con un cubreobjetos. Una vez hecho esto, observe la muestra con un microscopio invertido utilizando un objetivo 10X.
Realice tres réplicas independientes utilizando aproximadamente la misma densidad de polen para cada réplica. Para la polinización, use un cepillo de polinización para esparcir una cantidad suficiente de polen viable en la superficie del estigma, asegurándose de no dañar el pistilo. Cubra las flores polinizadas con una bolsa de papel sulfato y evite la polinización por pólenes genotípicamente distintos sellando la bolsa con un clip.
Escriba el nombre de la especie y el número y el tiempo de polinización en la etiqueta. Cuelgue la etiqueta en las ramas cerca de las flores polinizadas. Retire las bolsas de polinización aproximadamente tres o cuatro días después de la polinización y recoja las flores polinizadas en bolsas con cierre hermético.
Retire inmediatamente los pétalos, receptáculos y ovarios de las flores y sumerja el estigma fusionado al estilo en un tubo de centrífuga que contenga una solución fijadora recién preparada. Incubar el estigma y el estilo en la solución fijadora durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, deseche la solución fijadora antes de lavar el estigma y peine dos o tres veces en etanol al 95%.
Luego, agregue una solución de etanol al 70% al estilo, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida en la solución. Los estilos en esta etapa se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante uno o dos meses. Para la tinción de azul de anilina, lave las muestras de estilo almacenadas en etanol al 70% con agua destilada de tres a cuatro veces.
Sumérjalo en una solución de hidróxido de sodio de cuatro molares y séllelo antes de incubarlo en un baño de agua de 65 grados centígrados durante 60 minutos. Durante este paso, el color del estilo cambia de amarillo-blanco a naranja-rojo. A continuación, remoje los estilos en agua destilada.
Después de 30 minutos, deseche el agua destilada y lave los estilos con agua destilada de tres a cuatro veces o hasta que el color del estilo se vuelva amarillo. Luego, agregue el azul de anilina hasta que la muestra se sumerja e incube durante 12 horas en la oscuridad. Observe el crecimiento del tubo polínico bajo el microscopio de fluorescencia.
Coloque la diapositiva sobre una mesa plana. Divide el estilo en dos mitades a lo largo del eje longitudinal con un bisturí. Coloque la mitad del estilo en un portaobjetos de vidrio y agregue de dos a tres gotas de polietilenglicol a la superficie del portaobjetos.
Luego, cúbralo con un cubierto. Una vez hecho esto, coloque el portaobjetos en la plataforma del microscopio por encima de la abertura y visualice usando un objetivo 10X. Utilice el filtro DAPI y observe el crecimiento del tubo polínico.
Observe cinco estilos para cada tipo de polinización. La viabilidad polínica de Citrus maxima y las tasas de germinación se cuantificaron mediante microscopía fluorescente. El polen compatible germinó con éxito en la superficie del estigma y produjo un tubo polínico normal, que creció y finalmente condujo a la fertilización en el ovario.
En contraste, los tubos de polen incompatibles crecieron a través de aproximadamente 2/3 del estilo y luego dejaron de crecer. La electroforesis en gel de agarosa detectó el producto de ADN amplificado utilizando los cebadores específicos del locus S. Mostró la amplificación del producto de ADN entre 500 y 1.000 pares de bases.
Se identificó el genotipo S correspondiente. Se identificaron 21 haplotipos S en diferentes especies de cítricos utilizando este método. El paso de polinización es crítico.
Solo la polinización exitosa puede garantizar la observación posterior de los tubos de polen. La técnica se utilizó para analizar los rasgos de autoincompatibilidad y para explorar e identificar los determinantes femeninos de la autoincompatibilidad. Este método es importante para la investigación de la autoincompatibilidad y los programas de mejoramiento.
También puede facilitar a la comunidad agrícola la selección de árboles polinizadores para sus huertos.
