Este método puede ayudar a determinar los requisitos de polinización en diferentes especies y establecer relaciones de incompatibilidad entre cultivares. La principal ventaja de este enfoque es que permite evaluar varias incompatibilidades en condiciones de laboratorio. Evitar los numerosos problemas que pueden ocurrir en experimentos realizados en condiciones de campo.
Esto permite la identificación junto con la dedicación de un número de cultivar a los grupos de incompatibilidad correspondientes. Determinar la relación de interconsabilidad entre cultivares. Este enfoque también puede ser útil para determinar la autoincompatibilidad y la relación de incompatibilidad en otros cultivos de árboles frutales como la cereza o la ciruela.
Comience probando las flores en el campo. Recoger las flores en la etapa de globo, que corresponde a la etapa 58 en la escala de la BBCH para el albaricoque para evitar la polinización previa. En el laboratorio, retire las anteras de las flores y colóquelas en un pedazo de papel para secar a temperatura ambiente.
Después de 24 horas, tamiza los granos de polen con una fina malla de 26 milímetros. Emascular un grupo de 30 flores en la misma etapa de desarrollo de globos para cada auto-y polinización cruzada y colocar las pistolas en espuma florista en agua 24 horas después de la emasculación y polinizar las pistolas usando un cepillo de pintura con polen de flores del mismo cultivar. Polinizar otro conjunto de pistolas de cada cultivar con polen de las flores de un polinizador compatible como control.
Después de 72 horas, retire las pistolas de la espuma florista húmeda y fije las pistolas en una solución fija de 3:1 etanol al ácido acético durante al menos 24 horas a 4 grados centígrados. A continuación, deseche el fijador y agregue 75%etanol, asegurándose de que las muestras estén completamente sumergidas en la solución. Las muestras se pueden almacenar en el etanol a 4 grados centígrados hasta su uso.
Dispersar los granos de polen de los mismos cultivares utilizados para las polinizaciones de control en medio de germinación de polen solidificado y observarlos bajo el microscopio después de 24 horas. Prepare las pistolas para la microscopía lavándolas 3 veces con agua destilada durante una hora por lavado. Después del último lavado, déjelos en 5% de sulfito de sodio a 4 grados centígrados durante 24 horas.
Luego los autoclave a un kilogramo por centímetro cuadrado durante 10 minutos en sulfito de sodio para suavizar el tejido. Coloque las pistolas autoclavadas sobre un tobogán de vidrio y use un bisturí para eliminar los tricomas alrededor del ovario. A continuación, aplastar la pistola con un vaso de cubierta.
Aplique una gota de azul anilina sobre las preparaciones para manchar las deposiciones insensibles durante el crecimiento del tubo de polen y observar los tubos de polen a lo largo del estilo con un microscopio de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Utilice un kit comercial para extraer ADN genómico de hojas jóvenes recogidas en la primavera. A continuación, configure PCR combinando reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Vortexing la mezcla de reacción y distribución entre los pozos en la placa PCR. Añadir 1 microlitro de la dilución de ADN en cada pozo y ejecutar PCR utilizando el programa de termo-ciclo descrito en el manuscrito. Una vez completada la reacción, analizar los resultados utilizando electroforesis capilar o electroforesis de gel de agarosa.
Para la electroforesis capilar añadir 1 microlitro del producto PCR en el pozo de la placa lectora junto con 1 gota de aceite mineral para evitar la evaporación del agua. A continuación, prepare la placa de separación añadiendo el búfer de separación. Utilice el software comercial del analizador de genes para crear una nueva placa de muestra y guardar los nombres de muestra para todos los pozos de la placa.
A continuación, seleccione el método de análisis e inserte las dos placas en el analizador de genes. Llene la matriz capilar con agua destilada. Cargue el gel lineal de poliacrilamida y haga clic en Ejecutar.
Si analiza los resultados de la PCR con electroforesis de gel, prepare un gel de 1% de agarosa disolviendo la agarosa en el búfer de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. A continuación, agregue 4 microlitros de mancha de ácido nucleico al gel y mezcle suavemente. Configure una bandeja de gel con un peine y ralentite verter el gel en el medio teniendo cuidado de evitar burbujas.
Dejar el gel a temperatura ambiente hasta que esté completamente solidificado, unos 30-45 minutos. Luego poner en la cámara de electroforesis. Retire el peine y cúbralo con 1x tampón TAE.
Cargue el gel con la escalera de ADN seguido de los productos PCR mezclados con tinte de carga. A continuación, ejecute el gel a 90 voltios durante 60-90 minutos hasta que la línea de tinte azul esté en aproximadamente el 75% del carril de gel. Una vez finalizada la carrera, visualice el gel con un transilluminator.
El crecimiento del tubo de polen en las polinizaciones cruzadas y auto-y cruzadas se observó por microscopía de fluorescencia para determinar la auto(in)compatibilidad para cada cultivar. Los cultivares se consideraban autocomen incompatibles cuando el crecimiento del tubo de polen fue arrestado y auto-compatible cuando al menos un tubo de polen alcanzó la base del estilo. Se utilizaron 5 combinaciones de pares de imprimaciones para identificar los alelos S utilizando PCR en combinación con electroforesis capilar o gel.
En primer lugar, los S-alleles fueron identificados por la amplificación del primer intrón S-RNase utilizando el par de imprimación SRc. Luego el segundo intrón de la RNase se amplió con tres conjuntos de imprimación para distinguir los alelos S6, S9, S1 y S7. Y las regiones variables V2 y HVB del gen SFB se amplificaron con la imprimación AprFBC8 para identificar los alelos Sc y S8.
Una vez identificados los S-alleles, se pueden establecer diferentes grupos de incompatibilidad con los genotipos que son intercomen incompatibles. Es importante recordar el control en la electroforesis capilar, ya que utilizan un sistema de análisis automático de fragmentos que puede reportar como más diferencias en el tamaño del fragmento causando la identificación inexacta del alelo. La combinación de observaciones de microscopía y análisis genéticos ha dado como resultado un enfoque muy útil para determinar la autoincompatibilidad en el albaricoque y establecer las relaciones de incompatibilidad entre los cultivares.
La autoincompatibilidad es ahora el vínculo con los lugareños en el albaricoque. La determinación de los factores parece estar involucrada. El esfuerzo futuro debe centrarse en la edificación genética de este cultivar en albaricoque.
La combinación de este enfoque documental se traduce en información valiosa para la selección adecuada de cultivares en huertos comerciales y genotipos de patrones en programas de cría de albaricoque. Un enfoque similar se puede utilizar en otros cultivos perennes leñosos.
