Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético

CaV1.1, un miembro de los canales iónicos dependientes de voltaje, tiene cuatro sensores de voltaje distintos. La evidencia sugiere que algunos sensores de voltaje contribuyen más a la activación del receptor de rianodina o a la corriente de calcio. Nuestro objetivo es poder identificar el papel preciso de cada sensor de voltaje en el acoplamiento excitación-contracción y la activación del canal de calcio.

El acoplamiento excitación-contracción se ha estudiado desde principios de los años 50, sin embargo, los detalles moleculares de cómo ocurre este proceso aún se desconocen. El reciente avance en la estructura microscópica ciroelectrónica del canal, la caracterización de la nueva proteína accesoria CaV1.1, el descubrimiento de la variante de empalme alternativo del canal y la identificación de mutaciones causantes de enfermedades han reavivado el interés en este campo. Muchas técnicas se utilizan en nuestro campo, desde la electrofisiología clásica y la biología molecular hasta técnicas más novedosas como la microscopía crioelectrónica, la simulación dinámica molecular, la degradación de proteínas dirigidas y la fluorometría funcional dirigida al sitio, así como células modificadas o modelos animales.

Actualmente, el combustible enfrenta varios desafíos experimentales. En un músculo esquelético, el tráfico adecuado y la comunicación entre CaV1.1 y RyR1, junto con muchas proteínas reguladoras, es crucial para apoyar el acoplamiento excitación-contracción. Los métodos para estudiar directamente estas interacciones proteína-proteína entre CaV1.1 y RyR1 faltan o están incompletos.

El laboratorio del Dr. Martin Schneider ha estado trabajando en el acoplamiento excitación-contracción durante décadas, caracterizando los mecanismos de detección de voltaje en CaV1.1, la liberación de calcio y los eventos localizados de liberación de calcio, conocidos como chispas de calcio. Recientemente, nuestro laboratorio ha estado implementando nuevas técnicas ópticas para investigar varios pasos del acoplamiento excitación-contracción y el movimiento del sensor de voltaje en células musculares adultas funcionales. Si bien esto se ha hecho anteriormente en un sistema de expresión heterólogo, nuestro protocolo ahora permite rastrear cambios conformacionales en sensores de voltaje CaV1.1 durante un potencial de acción propagado en su entorno nativo.

Nuestra nueva técnica nos permitirá investigar el movimiento preciso del sensor de voltaje necesario para el acoplamiento excitación-contracción. Queremos saber qué residuo de carga en cada S4 es crítico para su función, o exactamente cada translocación de S4, y toda esa translocación está relacionada con la apertura de CaV1.1 o la activación del receptor de rianodina.