Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

CaV1.1, un membro dei canali ionici voltaggio-dipendenti, ha quattro sensori di tensione distinti. L'evidenza suggerisce che alcuni sensori di tensione contribuiscono maggiormente all'attivazione del recettore della rianodina o alla corrente di calcio. Miriamo a essere in grado di identificare il ruolo preciso di ciascun sensore di tensione nell'accoppiamento eccitazione-contrazione e nell'attivazione dei canali del calcio.

L'accoppiamento eccitazione-contrazione è stato studiato fin dai primi anni '50, ma i dettagli molecolari di come avviene questo processo sono ancora sconosciuti. I recenti progressi nella struttura microscopica del canale ciroelettronico, la caratterizzazione della nuova proteina accessoria CaV1.1, la scoperta della variante di splicing alternativo del canale e l'identificazione di mutazioni che causano malattie hanno riacceso l'interesse in questo campo. Molte tecniche sono utilizzate nel nostro campo, dall'elettrofisiologia classica e biologia molecolare a tecniche più nuove come la microscopia crioelettronica, la simulazione dinamica molecolare, la degradazione proteica mirata e la fluorometria funzionale diretta dal sito, nonché cellule ingegnerizzate o modelli animali.

Attualmente, il carburante deve affrontare diverse sfide sperimentali. In un muscolo scheletrico, il corretto traffico e la comunicazione tra CaV1.1 e RyR1, insieme a molte proteine regolatorie, è fondamentale per supportare l'accoppiamento eccitazione-contrazione. I metodi per studiare direttamente queste interazioni proteina-proteina tra CaV1.1 e RyR1 sono mancanti o incompleti.

Il laboratorio del Dr.Martin Schneider ha lavorato per decenni sull'accoppiamento eccitazione-contrazione, caratterizzando i meccanismi di rilevamento della tensione in CaV1.1, il rilascio di calcio e gli eventi localizzati di rilascio di calcio, noti come scintille di calcio. Recentemente, il nostro laboratorio ha implementato nuove tecniche ottiche per studiare varie fasi dell'accoppiamento eccitazione-contrazione e del movimento del sensore di tensione nelle cellule muscolari adulte funzionanti. Mentre questo è stato fatto in precedenza in un sistema di espressione eterologo, il nostro protocollo ora consente di tracciare i cambiamenti conformazionali nei sensori di tensione CaV1.1 durante un potenziale d'azione propagato nel suo ambiente nativo.

La nostra nuova tecnica ci permetterà di studiare il movimento preciso del sensore di tensione necessario per l'accoppiamento eccitazione-contrazione. Vogliamo sapere quali residui di carica in ogni S4 sono critici per la sua funzione, o esattamente ogni traslocazione S4, e tutto ciò che è traslocato è legato all'apertura del CaV1.1 o all'attivazione del recettore della rianodina.