Este trabajo fue apoyado por un premio de Innovación y Desarrollo Tecnológico del Centro para el Desarrollo de Terapias del Instituto Broad del MIT y Harvard. Los autores desean agradecer a los miembros del equipo directivo superior y al comité de revisión por su apoyo a este trabajo.

Todas las proteínas fueron sobreexpresadas en E. coli con buen rendimiento y pureza (>80%) siguiendo los protocolos de la literatura18. La biotinilación se llevó a cabo mediante una reacción catalizada por BirA18. Todas las moléculas pequeñas se prepararon en soluciones madre de 1 mM en 100% DMSO. Los procedimientos descritos en este documento no requieren equipo de seguridad de laboratorio especializado ni precauciones. Se debe usar equipo de protección personal (EPP) estándar de laboratorio (es decir, bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes).
Las proteínas aplicadas en este estudio se enumeran a continuación: VHL: complejo VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) biotinilado con Avi-tag en el extremo C-terminal de ElonginB. Brd4BD2: Brd4BD2 sin etiquetar(333-460) CRBN: CRBN biotinilado (319-442) con Avi-tag en el extremo N PPM1D: PPM1D(1-420) no marcado o doble marcado con His8 en el extremo N
Las moléculas pequeñas aplicadas en este estudio se enumeran a continuación: MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC que se une a BVS y Brd4BD2 BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~3 μM, no se une a PPM1D BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM BRD-4761 (MW = 476,6 Da): no se une a CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM
1. Método 1: ITC (calorimetría de titulación isotérmica)
NOTA: Las valoraciones se realizan mediante un microcalorímetro con autoinyección.
<ol><li>Preparación del tampón: Preparar 3 L de tampón que contenga 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, pH 7,5.</li>
	<li>Diálisis: Diálisis de VHL y Brd4BD2 (~ 500 μL a 150 μM cada uno) contra 1 L del tampón preparado en el paso 1.1, 3 veces a 4 °C, durante 4 h, 2 h y aproximadamente 16 h, respectivamente. Guarde el tampón después de la última diálisis para usarlo en los pasos posteriores.</li>
	<li>Prepare las muestras en una placa de 96 pocillos con una cubierta de plástico.<ol><li>Para cada valoración, prepare 400 μl de solución para la célula, 125 μl para la jeringa y 400 μl de tampón para la limpieza. Agregue muestras a tres pocillos consecutivos en la placa. Dado que el material compuesto se prepara a 1 mM en DMSO al 100%, agregue el mismo porcentaje de DMSO a las soluciones proteicas para garantizar el tampón correspondiente en la célula y la jeringa. Agregue un 2% de DMSO a las soluciones finales.<ol><li>Muestra para la valoración de la enfermedad de VHL en MZ1: Prepare una solución celular que contenga 392 μL de tampón, 4 μL de MZ1 a 1 mM (concentración final de 10 μM) y 4 μL de DMSO al 100 %. Prepare una solución de jeringa que contenga 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO al 100% (concentración final de 84 μM).</li>
			<li>Muestras para la valoración de la BVS en el tampón (los datos se utilizarán para la sustracción de fondo de los datos generados a partir de la muestra 1.3.1.1): Preparar una solución celular que contenga 392 μL tampón, 8 μL de DMSO al 100%. Prepare una solución de jeringa que contenga 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentración final de 84 μM) y agregue 2,5 μL de DMSO al 100%.</li>
			<li>Muestras para la valoración de la enfermedad VHL en MZ1 y Brd4 BD2: Prepare una solución celular que contenga 392 μL de 17,1 μM de Brd4BD2 (concentración final de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 a 1 mM (concentración final de 8,4 μM) y 4,64 μL de DMSO al 100 %. Prepare una solución de jeringa que contenga 122,5 μl de VHL a 85,7 μM (concentración final de 84 μM) y 2,5 μl de DMSO al 100 %.</li>
			<li>Muestras para la valoración de la enfermedad VHL en Brd4 BD2 (antecedentes de 1.3.1.3): Prepare una solución celular que contenga 392 μL de 17,1 μM de Brd4BD2 (concentración final de 16,8 μM) y 8 μL de DMSO al 100%. Prepare una solución de jeringa que contenga 122,5 μl de VHL a 85,7 μM (concentración final de 84 μM) y 2,5 μl de DMSO al 100 %.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Ejecute las cuatro valoraciones en el microcalorímetro. Cada una consta de 19 inyecciones de solución de jeringa de 2 μL a una velocidad de 2 μL/s a intervalos de tiempo de 120 s. Realice una inyección inicial de proteína (0,4 μL) y deséchela durante el análisis de los datos. Realice todos los experimentos a 25 °C, agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Análisis de los datos: Ajuste los datos a un modelo de un solo sitio de unión para obtener la estequiometría (n), la constante de disociación (KD) y la entalpía de unión (ΔH) utilizando el software de análisis proporcionado por el fabricante (Figura 2).</li>
</ol>2. Método 2: BLI (interferometría de biocapas)
<ol><li>Realizar experimentos BLI utilizando sensores recubiertos de estreptavidina (SA) a temperatura ambiente (RT) con una tasa de adquisición de 5 Hz. Durante el experimento BLI automatizado, asegúrese de que los sensores estén estacionarios dentro de una sola columna y se muevan entre las diferentes columnas de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos con un volumen máximo de pocillos de 392 μL. Llene cada pocillo de la placa utilizada en el experimento con 200 μL de solución. NOTA: BLI solo es útil para detectar interacciones proteína-proteína (es decir, formación de complejos ternarios). No es lo suficientemente sensible como para detectar interacciones entre proteínas y moléculas pequeñas.<ol><li>Preparación del tampón: Preparar 100 mL de tampón que contenga 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,05% de P20, pH 7,5.</li>
		<li>Optimización para la etapa de inmovilización: Cargue el sensor de prueba a 1-3 nm, según lo recomendado por el fabricante. Se utiliza una carga de ~1,0 nm para los procedimientos descritos aquí. Para lograr esto, sumerja el sensor en una solución que contenga VHL a 1,5 μg/mL durante 80 s.</li>
		<li>Realice mediciones cinéticas BLI aplicando siete sensores SA utilizando la siguiente secuencia:<ol><li>Para la primera fase de referencia, sumérjase en el tampón durante 60 s.</li>
			<li>Para la fase de inmovilización, sumergir en una solución de VHL a 1,5 μg/mL durante 80 s.</li>
			<li>Para la segunda fase de referencia, sumérjase en el tampón durante 60 s.</li>
			<li>Para la fase de asociación, sumergir en una solución una concentración fija de Brd4BD2 a 2 μM, una concentración fija de DMSO al 2% y concentraciones variables de MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM y 0 nM (sensor de referencia) durante 300 s.</li>
			<li>Para la fase de disociación, sumérjase en el tampón durante 600 s.</li>
		</ol></li>
		<li>Realice análisis de datos utilizando el software del fabricante. k on, k off y kd se informan para el ajuste de datos (Figura 3). </li>
	</ol></li>
</ol>3. Método 3: SPR (resonancia de plasmón de superficie)
NOTA: Todos los experimentos de SPR se llevan a cabo utilizando chips sensores recubiertos de estreptavidina (SA) en RT. Aunque el chip NTA se utiliza para la detección entre proteínas y moléculas pequeñas, debe usarse con precaución cuando se aplica al complejo ternario, ya que se observa un fondo mucho más alto que el chip SA, posiblemente debido a las interacciones electrostáticas entre la superficie del chip cargado y la proteína en el analito.
<ol><li>SPR para la interacción BVS-MZ1<ol><li>Preparación del tampón.<ol><li>Prepare un tampón de 1 L que contenga 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,005% de P20, pH7,5 y páselo a través de una unidad de filtro de 0,2 μm.</li>
			<li>Retire 20 ml de tampón para uso futuro (tampón sin DMSO) y rellene con 20 ml de DMSO (2 % de DMSO en el tampón de ejecución final). Mantenga el DMSO al 2% en todas las muestras que se describen a continuación (pasos 3.1 y 3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>Activar el chip SA siguiendo el protocolo del fabricante e inmovilizar la VHL a ~2000 RU (inyectar solución proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Prepare MZ1 en una dilución seriada de 3 veces y 8 puntos con una concentración superior de 10 μM en una placa de polipropileno translúcida de fondo cónico de 384 pocillos con un volumen máximo de 130 μL. Cubra la placa con láminas de plástico transparentes autoadhesivas compatibles con microplacas de polipropileno.<ol><li>Prepare la concentración máxima con el tampón libre de DMSO para garantizar el 2% de DMSO en la concentración final. A 147 μL de tampón libre de DMSO, agregue 1,5 μL de material MZ1 a 1 mM y 1,5 μL de DMSO al 100%.</li>
			<li>Prepare la dilución en serie de 3 veces con el tampón de funcionamiento que contiene un 2% de DMSO. A 100 μL del tampón corriente, añadir 50 μL de solución a la concentración máxima preparada en el paso 3.1.3.1, y mezclar bien para preparar la2ª concentración más alta.</li>
			<li>A continuación, transfiera 50 μL de la solución preparada en el paso 3.1.3.2 a los siguientes 100 μL de tampón corriente, mezcle bien para preparar la3ª concentración más alta, y así sucesivamente.</li>
		</ol></li>
		<li>Ejecute SPR utilizando la configuración de varios ciclos: Modo: Alto rendimiento; tiempo de contacto: 120 s; tiempo de disociación: 300 s; caudal: 50 μL/min.</li>
		<li>Realice el análisis de datos utilizando el software de evaluación proporcionado por el fabricante del instrumento. El análisis en estado estacionario indicó que KD = 26 (± 3) nM y Rmax de ~91% (± 5%) de unión lograda (Figura 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para BVS: MZ1: complejo ternario Brd4BD2<ol><li>Prepare el búfer como se describe en el paso 3.1.1.</li>
		<li>Active el chip SA siguiendo el protocolo del fabricante e inmovilice la VHL a ~100 RU. Inyectar una solución proteica de 0,5 μg/mL de VHL a un caudal de 5 μL/min y un tiempo de contacto entre 1-5 min hasta alcanzar una densidad superficial de ~100 RU.</li>
		<li>Prepare las muestras para dos inyecciones de ciclo único de 5 puntos y 5 veces en una placa inferior redonda de poliestireno transparente de 96 pocillos con un volumen máximo de 323 μL y cúbrala con láminas de plástico transparentes autoadhesivas que sean compatibles con las microplacas de poliestireno como se describe en los pasos 3.2.3.1-3.2.3.2.<ol><li>Control negativo: el analito contiene Brd4BD2 solamente.<ol><li>Preparar la concentración máxima a 25 μM en tampón de funcionamiento con un volumen de 200 μL (#A5)</li>
				<li>Agregue 160 μL de Brd4BD2 a 2 μM en el tampón de funcionamiento a los siguientes 4 pocillos de la izquierda (#A1-A4)</li>
				<li>Transfiera 40 μL de A5 a A4. Mezclar bien.</li>
				<li>Transfiera 40 μL de A4 a A3. Mezclar bien. Siga haciéndolo hasta A1.</li>
			</ol></li>
			<li>Formación de complejos ternarios: el analito contiene MZ1 y Brd4BD2.<ol><li>Prepare la concentración máxima añadiendo 4 μL de MZ1 a 20 μM en una solución de DMSO al 100% a 196 μL que contengan 25,5 μM de Brd4BD2 en tampón libre de DMSO (#B5). Las concentraciones finales son 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 y 2% DMSO.</li>
				<li>Agregue 160 μL de Brd4BD2 a 2 μM en el tampón de funcionamiento a los siguientes 4 pocillos de la izquierda (#B1-B4)</li>
				<li>Transfiera 40 μL de B5 a B4. Mezclar bien.</li>
				<li>Transfiera 40 μL de B4 a B3. Mezclar bien. Sigue haciéndolo hasta B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Ejecute SPR utilizando la configuración de ciclo único: Tiempo de contacto: 100 s; tiempo de disociación: 720 s; caudal: 50 μL/min. Aplique tres inyecciones de tampón antes de cada muestra para garantizar un fondo estable.</li>
		<li>Análisis de datos: Aplique la tercera inyección del búfer como fondo para la resta. Como control negativo, cuando MZ1 no está presente, la respuesta de SPR entre VHL y Brd4BD2 es despreciable. Cuando MZ1 está presente, el ajuste cinético indica que la interacción entre VHL y el complejo MZ1-Brd4BD2 tiene k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 y KD = 1 nM. (Figura 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para CRBN e interacciones de moléculas pequeñas<ol><li>Preparación del tampón.<ol><li>Prepare un tampón de 1 L que contenga 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de MgCl 2, 0,5 mM de TCEP, 0,005% de P20, pH 7,5 y páselo por una unidad de filtro de0,2 μm.</li>
			<li>Retire 20 ml de tampón y rellene 20 ml de DMSO al 100 % (2 % de DMSO en el tampón de ejecución final). Es importante mantener el DMSO al 2% en todas las muestras que se describen a continuación (pasos 3.3, 3.4 y 3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>Active el chip SA siguiendo el protocolo del fabricante e inmovilice CRBN a ~800 RU.</li>
		<li>Preparar los compuestos en una dilución seriada de 3 veces y 6 pt en una placa de 384 pocillos con una concentración máxima de 30 μM, como se describe en el punto 3.1.3.</li>
		<li>Ejecute SPR utilizando la configuración de ciclo múltiple: Modo: Alto rendimiento, tiempo de contacto: 60 s, tiempo de disociación: 90 s; caudal: 50 μL/min. Para este sistema, tres inyecciones de tampón son suficientes para obtener un fondo estable. Para otros sistemas de ensayo, puede ser necesario realizar inyecciones de tampón adicionales.</li>
		<li>Realice análisis de datos utilizando el software del fabricante. NOTA: El análisis de estado estacionario indica que KD de BRD-2512 y BRD-5110 son de alrededor de 3 μM. Sin embargo, la unión solo alcanzó ~ 70%de unión máxima de R en la concentración superior. Tanto la afinidad débil como la forma del sensorgrama indican que es probable que ocurra insolubilidad de compuestos a altas concentraciones. Por lo tanto, el KD real podría ser superior a 3 μM. BRD-4761, que no se une a CRBN, se incluyó como control negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para PPM1D e interacciones de moléculas pequeñas<ol><li>Prepare el búfer como se describe en el paso 3.3.1. Utilice un chip sensor de ácido nitriloacético (NTA).</li>
		<li>Aplique un solo ciclo porque la ojiva PPM1D tiene un encendido y apagado k lentos. Regenere el chip NTA utilizando la configuración predeterminada del fabricante e inmovilice PPM1D a ~ 1000 RU después de cada inyección de compuesto (inyecte una solución de proteína de 5 μg/ml a 5 μl/min).</li>
		<li>Preparar los compuestos en una dilución seriada de 3 veces y 5 puntos con la concentración máxima a 400 nM, como se describe en el punto 3.1.3.</li>
		<li>Ejecute SPR utilizando la configuración de un solo ciclo: Modo: alto rendimiento; Tiempo de contacto: 90 s; tiempo de disociación: 600 s; caudal: 50 μL/min. Aplique tres inyecciones de tampón antes de cada compuesto para garantizar un fondo estable.</li>
		<li>Análisis de datos. Aplique la tercera inyección del búfer como fondo para la resta. Como control negativo, BRD-2512 no muestra unión a PPM1D. Para BRD-4761 y BRD-5110, el ajuste cinético indicó que el KD para ambos era de 1-2 nM.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para CRBN:PROTAC: Complejo ternario PPM1D<ol><li>Prepare el búfer como se describe en el paso 3.3.1.</li>
		<li>Activar el chip SA siguiendo el protocolo del fabricante e inmovilizar CRBN a ~35 RU (inyectar una solución proteica de 0,5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparar tres compuestos en una dilución seriada de 3 veces y 6 puntos con una concentración máxima de 30 μM manteniendo [PPM1D] a 1 μM en todas las muestras, incluidos los blancos, utilizando el método descrito en el paso 3.2.3.</li>
		<li>Ejecute SPR utilizando la configuración de varios ciclos: Modo: Alto rendimiento; Tiempo de contacto: 60 s; tiempo de disociación: 90 s; caudal: 50 μL/min.</li>
		<li>Realice análisis de datos utilizando el software del fabricante. NOTA: Mientras que BRD-2512 y BRD-4761 muestran una respuesta nula o insignificante, BRD-5110 muestra claramente el "efecto gancho" en el estado estacionario con una cinética rápida de encendido/apagado (Figura 5A-C). La respuesta de unión experimental de BRD-5110 (Figura 5C) se encuentra entre la respuesta predicha de la simulación cuando se asume que K D (CRBN, cpd) es de 3 o 10 μM (Figura 5E), lo que sugiere que el K D ternario y el KD binario son muy similares. No hay cooperación aparente de PPM1D: BRD-5110: formación del complejo CRBN.</li>
	</ol></li>
</ol>

Caracterización de la formación de complejos ternarios en PROTACs mediante ensayos biofísicos

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome.">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li><li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy.">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li><li>Toure, M., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+PROTACS:+New+approaches+to+protein+degradation.">Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation.</a> Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).</li><li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation.">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li><li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

La caracterización biofísica de las interacciones binarias y ternarias entre las moléculas PROTAC y sus socios de unión a proteínas puede proporcionar información única y complementaria en relación con los sistemas celulares ampliamente utilizados. Comprender la afinidad entre cada ojiva de una molécula PROTAC y sus socios de unión a proteínas puede ayudar a guiar los esfuerzos de química médica hacia la optimización de esas interacciones. Las estructuras cristalinas de los complejos ternarios PROTAC public...

La poliubiquitinación de proteínas en la célula es un proceso estrechamente regulado que involucra enzimas de la familia de la ubiquitina ligasa 1,2. Las enzimas terminales en la vía son las ligasas de ubiquitina E3 que unen covalentemente las moléculas de ubiquitina a sus socios de unión a proteínas3. La poliubiquitinación de esos socios de unión a proteínas se dirige a ellos para la degradación proteolítica por el proteasoma4. Este sistema forma parte del proceso de homeostasis de proteínas que se ha aprovechado terapéuticamente para inducir la degradación de proteínas implicadas en la enfermedad5. Las moléculas pequeñas que inducen la interacción entre las ligasas de ubiquitina E3, como la ligasa E3 de Von Hippel-Lindau (VHL) o el cereblon (CRBN), suelen estar compuestas por una ojiva de unión a la ligasa E3 conectada por un enlazador flexible a una ojiva que se une a la proteína que se destina a la degradación. Estas moléculas heterobifuncionales se conocen comúnmente como quimeras dirigidas a la proteólisis o PROTACS6.
El desarrollo de PROTACS implica la evaluación de la capacidad de las moléculas para inducir la degradación de proteínas en las células. Se han desarrollado muchos sistemas de ensayo celular que monitorizan la interacción inducida entre la proteína diana y los componentes de la ligasa E3, como VHL o CRBN, tras el tratamiento de las células con una molécula PROTAC. Uno de estos ensayos celulares, el sistema nanoluc-Halotag7, involucra una ligasa E3 fusionada con el aceptor de Halotag y una proteína diana marcada con un donante de nanoluc. La formación de complejos ternarios acerca el donante de nanoluc y el aceptor de Halotag, lo que permite la transferencia de energía del donante al aceptor, lo que resulta en la emisión de luz. Las variaciones de este sistema se pueden utilizar para evaluar la permeabilidad celular de las moléculas PROTACS8 o los cambios en el nivel relativo de ubiquitinación de la proteína diana9. Si bien estos sistemas celulares son esenciales para impulsar la optimización de PROTACS, la formación de complejos entre las ligasas E3 y las proteínas destinadas a la degradación es un proceso de varios pasos10,11. La cinética y termodinámica de las interacciones binarias y ternarias involucradas contribuyen a la eficiencia, ubiquitinación y la degradación resultante de la proteína12,13,14.
En este trabajo se describen los protocolos que pueden adaptarse para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por PROTACS utilizando resonancia de plasmón de superficie (SPR), interferometría de biocapas (BLI) y calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Los protocolos SPR e ITC para la molécula MZ1 PROTAC que induce la formación de complejos ternarios entre Brd4BD2 y VHL derivados de los reportes de la literatura13,15 y aquí descritos fueron capaces de recapitular los resultados reportados con alguna modificación de los procedimientos reportados, los cuales serán discutidos. En este informe se incluye una descripción de un ensayo BLI utilizado para evaluar la formación de complejos ternarios entre MZI, Brd4BD2 y VHL. Las mediciones de afinidad de BLI fueron consistentes con las observadas en SPR e ITC. También se describe un protocolo previamente publicado en el que se desarrolló un ensayo SPR para evaluar la formación de complejos ternarios inducidos por PROTAC entre PPM1D, una proteína fosfatasa Ser/Thr cuya expresión es inducida de forma dependiente de p5316, y CRBN. En este caso, la molécula PROTAC tiene una afinidad nanomolar por PPM1D, pero solo una afinidad micromolar por CRBN. En este caso, la unión de la molécula PROTAC a CRBN no es saturable, lo que da lugar al "efecto gancho" comúnmente observado. El efecto gancho es una propiedad de tres sistemas corporales en los que hay dos especies que pueden formar un complejo heterotrimérico cuando ambas están unidas a una molécula puente (Figura 1)17. El efecto gancho se observa cuando la especie puente está en exceso de concentración en relación con las otras dos especies. El estado resultante es aquel en el que las interacciones binarias superan a las interacciones ternarias. Los sistemas en los que se observa el efecto gancho requieren consideraciones específicas de diseño experimental que se analizan en este informe. Se proporcionan conceptos generales y requisitos de reactivos para evaluar la utilización de ensayos biofísicos para la evaluación de la formación de complejos ternarios inducidos por PROTAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

Las ligasas E3 y las proteínas destinadas a la degradación pueden ser inducidas a formar complejos por moléculas heterobifuncionales en un proceso de varios pasos. La cinética y la termodinámica de las interacciones involucradas contribuyen a la eficiencia de la ubiquitinación y la degradación resultante de la proteína. Las técnicas biofísicas como la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) proporcionan información valiosa que se puede utilizar en la optimización de esas interacciones. Utilizando dos sistemas modelo, se estableció un conjunto de herramientas de ensayo biofísico para comprender la cooperatividad de la formación de complejos ternarios y el impacto del "efecto gancho" en la cinética de unión. En un caso, se evaluó una molécula de proteólisis dirigida a quimera (PROTAC) que indujo la formación de complejos ternarios entre Brd4BD2 y VHL. La molécula heterobifuncional, MZ1, tiene afinidades nM tanto por la proteína Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) como por el complejo BVS (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). Para este sistema, se desarrollaron ensayos robustos de SPR, BLI e ITC que reprodujeron los resultados publicados que demuestran la cooperatividad de la formación de complejos ternarios. En el otro caso, se estudió una molécula que indujo complejos ternarios entre una proteína de 46,0 kDa, PPM1D, y cereblon [CRBN (319-442)]. La molécula heterobifuncional, BRD-5110, tiene una SPR K D = 1 nM para PPM1D pero una unión mucho más débil contra el complejo CRBN truncado (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). En ese caso, la unión de CRBN en SPR no era saturable, lo que daba lugar a un "efecto gancho". Se evaluaron los requisitos de rendimiento y reactivos para SPR, BLI e ITC, y se proporcionaron recomendaciones generales para su aplicación a los proyectos PROTAC.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

Autor destacado: Evaluación de ensayos biofísicos para la caracterización de complejos ternarios PROTACS 

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

La caracterización del complejo binario BVS: MZ1 y del complejo ternario BVS: MZ1: Brd4BD2 se puede encontrar en la Figura 2 (ITC), la Figura 3 (BLI) y la Figura 4 (SPR) utilizando un tampón muy similar. El KD extraído de los ensayos ortogonales es consistente. La cooperatividad se puede calcular por K D (binario) / KD (ternario), que es altamente positivo (15 de ITC o 26 de SPR).
...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN). Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Nuestra investigación se centra en replicar sistemas modelo establecidos, validarlos a través de ensayos adicionales y adaptar estas metodologías para adaptarse a nuestro contexto de investigación específico. Nuestro objetivo es demostrar un enfoque versátil que se puede aplicar a varios proyectos. El desafío experimental actual, la concesión de licencias seleccionando estratégicamente el formato y las condiciones de ensayo adecuadas en función de los requisitos específicos del proyecto y las lagunas de conocimiento existentes.Esto es esencial para lograr respuestas eficientes y precisas en nuestros experimentos. Nuestro protocolo proporciona un enfoque optimizado para una adaptación perfecta a varios sistemas ProTech. Además, realizamos una evaluación exhaustiva de cada método, destacando sus respectivos pros y contras.Ofrecemos instrucciones informadas sobre cómo elegir el formato más adecuado en función de las condiciones específicas.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K vistas.  The Broad Institute of MIT and Harvard. Nuestra investigación se centra en replicar sistemas modelo establecidos, validarlos a través de ensayos adicionales y adaptar estas metodologías para adaptarse a nuestro contexto de investigación específico. Nuestro objetivo es demostrar un enfoque versátil que se puede aplicar a varios proyectos. El desafío experimental actual, la concesión de licencias seleccionando estratégicamente el formato y las condiciones de ensayo adecuadas en función de los requisitos específicos del pro...

Video: Autor destacado: Evaluación de ensayos biofísicos para la caracterización de complejos ternarios PROTACS 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).