עבודה זו נתמכה על ידי פרס חדשנות ופיתוח טכנולוגיה מהמרכז לפיתוח טיפולים במכון ברוד של MIT והרווארד. המחברים מבקשים להודות לחברי צוות ההנהגה הבכירה ולוועדת הביקורת על תמיכתם בעבודה זו.

כל החלבונים בוטאו יתר על המידה ב- E.coli עם תפוקה טובה וטוהר (>80%) בהתאם לפרוטוקולי הספרות18. ביוטינילציה בוצעה באמצעות תגובה זרזי BirA18. כל המולקולות הקטנות הוכנו בתמיסות מלאי של 1 מילימטר ב-100% DMSO. הנהלים המתוארים כאן אינם דורשים ציוד בטיחות מיוחד במעבדה או אמצעי זהירות. יש להשתמש בציוד מגן אישי סטנדרטי למעבדה (PPE) (כלומר, מעיל מעבדה, משקפי מגן וכפפות).
חלבונים שיושמו במחקר זה מפורטים להלן: VHL: קומפלקס VHL ביוטינילציה (53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC (17-112) עם Avi-tag במסוף C של ElonginB. Brd4BD2: לא מתויג Brd4BD2(333-460) CRBN: CRBN ביוטינילציה (319-442) עם תג Avi במסוף N PPM1D: PPM1D ללא תיוג או עם תיוג כפול של His8(1-420) במסוף N
מולקולות קטנות שיושמו במחקר זה מפורטות להלן: MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC שנקשר ל-VHL ול-Brd4BD2 BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN KD ~ 3 μM, אינו נקשר ל- PPM1D BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN K D ~ 3 μM, PPM1D KD = 1-2 ננומטר BRD-4761 (MW = 476.6 Da): אינו נקשר ל-CRBN, PPM1D KD = 1-2 ננומטר
1. שיטה 1: ITC (קלורימטריה טיטרציה איזותרמית)
הערה: הטיטרציות מבוצעות באמצעות מיקרו-קלורימטר עם הזרקה אוטומטית.
<ol><li>הכנת חיץ: להכין 3 ליטר של חיץ המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5.</li>
	<li>דיאליזה: Dialyze VHL ו- Brd4BD2 (~ 500 μL ב- 150 מיקרומטר כל אחד) כנגד 1 ליטר של החיץ שהוכן בשלב 1.1, 3 פעמים ב- 4 ° C, למשך 4 שעות, שעתיים וכ- 16 שעות, בהתאמה. שמור את המאגר לאחר הדיאליזה האחרונה לשימוש בשלבים הבאים.</li>
	<li>הכינו דוגמאות על צלחת 96 בארות עם כיסוי פלסטיק.<ol><li>עבור כל טיטרציה, להכין 400 μL של פתרון עבור התא, 125 μL עבור מזרק, ו 400 μL של חיץ לניקוי. מוסיפים דוגמאות לשלוש בארות רצופות בצלחת. מכיוון שמלאי התרכובת מוכן ב-1 מילימטר ב-100% DMSO, הוסיפו את אותו אחוז של DMSO לתמיסות החלבונים כדי להבטיח את החיץ התואם בתא ובמזרק. הוסף 2% DMSO לפתרונות הסופיים.<ol><li>דוגמה לטיטרציה של VHL לתוך MZ1: הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של חיץ, 4 μL של MZ1 ב 1 mM (ריכוז סופי של 10 μM), ו 4 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר, 2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר).</li>
			<li>דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך המאגר (הנתונים ישמשו לחיסור רקע של נתונים שנוצרו מדגם 1.3.1.1): הכן תמיסת תא המכילה מאגר 392 μL, 8 μL 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרו-מטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) והוסיפו 2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.</li>
			<li>דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך MZ1 ו- Brd4 BD2: הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של 17.1 μM Brd4BD2 (ריכוז סופי של 16.8 μM), 3.36 μL של MZ1 ב- 1 mM (ריכוז סופי של 8.4 μM) ו- 4.64 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) ו-2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.</li>
			<li>דוגמאות לטיטרציה של VHL לתוך Brd4 BD2 (רקע של 1.3.1.3): הכן תמיסת תאים המכילה 392 μL של 17.1 μM Brd4BD2 (ריכוז סופי של 16.8 μM) ו- 8 μL של 100% DMSO. הכינו תמיסת מזרק המכילה 122.5 מיקרוליטר VHL ב-85.7 מיקרומטר (ריכוז סופי של 84 מיקרומטר) ו-2.5 מיקרוליטר של 100% DMSO.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את כל ארבעת הטיטרציות על המיקרו-קלורימטר. כל אחת מהן מורכבת מ-19 זריקות של תמיסת מזרק 2 μL בקצב של 2 μL/s במרווחי זמן של 120 שניות. בצע הזרקה ראשונית של חלבון (0.4 μL) והשליך אותו במהלך ניתוח הנתונים. בצע את כל הניסויים ב 25 ° C, תוך ערבוב ב 600 סל"ד.</li>
	<li>ניתוח נתונים: התאימו את הנתונים למודל של אתר קשירה יחיד כדי לקבל את הסטויכיומטריה (n), קבוע הדיסוציאציה (KD) ואנתלפיה של קשירה (ΔH) באמצעות תוכנת הניתוח שסופקה על-ידי היצרן (איור 2).</li>
</ol>2. שיטה 2: BLI (אינטרפרומטריה biolayer)
<ol><li>בצע ניסויי BLI באמצעות חיישנים מצופים סטרפטווידין (SA) בטמפרטורת החדר (RT) עם קצב רכישה של 5 הרץ. במהלך ניסוי BLI אוטומטי, ודא שהחיישנים נייחים בתוך עמודה אחת ועוברים בין עמודות שונות של לוח שחור בעל 96 בארות, תחתית שטוחה, עם נפח באר מרבי של 392 μL. מלא כל באר של הצלחת ששימשה בניסוי עם 200 μL של תמיסה. הערה: BLI שימושי רק כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון (כלומר, היווצרות קומפלקס טרינרי). הוא אינו רגיש מספיק כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים ומולקולות קטנות.<ol><li>הכנת חיץ: להכין 100 מ"ל של חיץ המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.05% P20, pH 7.5.</li>
		<li>אופטימיזציה לשלב האימוביליזציה: טען את חיישן הבדיקה ל- 1-3 ננומטר, בהתאם להמלצת היצרן. טעינה של ~1.0 ננומטר משמשת להליכים המתוארים כאן. כדי להשיג זאת, טבלו את החיישן בתמיסה המכילה VHL ב-1.5 מיקרוגרם/מ"ל למשך 80 שניות.</li>
		<li>בצע מדידות קינטיות BLI על ידי הפעלת שבעה חיישני SA באמצעות הרצף הבא:<ol><li>בשלב הבסיס הראשון, יש לטבול במאגר למשך 60 שניות.</li>
			<li>לשלב האימוביליזציה, יש לטבול בתמיסה של VHL במינון של 1.5 מיקרוגרם/מ"ל למשך 80 שניות.</li>
			<li>בשלב הבסיס השני, יש לטבול במאגר למשך 60 שניות.</li>
			<li>עבור שלב האסוציאציה, יש לטבול בתמיסה של ריכוז קבוע של Brd4BD2 ב-2 מיקרומטר, ריכוז קבוע של DMSO ב-2%, וריכוזים משתנים של MZ1 ב-100 ננומטר, 50 ננומטר, 25 ננומטר, 12.5 ננומטר, 6.3 ננומטר, 3.1 ננומטר ו-0 ננומטר (חיישן ייחוס) למשך 300 שניות.</li>
			<li>עבור שלב הדיסוציאציה, לטבול לתוך חיץ במשך 600 שניות.</li>
		</ol></li>
		<li>בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן. k on, koff ו-KD מדווחים לצורך התאמת נתונים (איור 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. שיטה 3: SPR (תהודה פלסמונית פני השטח)
הערה: כל ניסויי SPR מתבצעים באמצעות שבבי חיישנים מצופים סטרפטאבידין (SA) ב- RT. למרות ששבב נת"ע משמש לזיהוי בין חלבון למולקולות קטנות, יש להשתמש בו בזהירות כאשר מיישמים אותו על המכלול הטרינרי, שכן נצפה רקע גבוה בהרבה משבב החומצה הסליצילית, אולי בשל אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין משטח השבב הטעון לחלבון באנליט.
<ol><li>SPR עבור אינטראקציה VHL-MZ1<ol><li>הכנת חיץ.<ol><li>הכינו חיץ 1 ליטר המכיל 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.005% P20, pH7.5, והעבירו אותו דרך יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר.</li>
			<li>הסר 20 מ"ל של מאגר לשימוש עתידי (מאגר ללא DMSO) ומלא מחדש ב- 20 מ"ל DMSO (2% DMSO במאגר הפועל הסופי). שמור על DMSO בשיעור של 2% בכל הדגימות המתוארות להלן (שלבים 3.1 ו-3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את VHL ל~2000 RU (הזרקת תמיסת חלבון של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-5 מיקרוליטר/דקה).</li>
		<li>הכינו את MZ1 בדילול טורי פי 3, 8 נקודות עם ריכוז עליון של 10 מיקרומטר על צלחת פוליפרופילן תחתונה חרוטית 384 באר, שקופה, עם נפח מרבי של 130 μL. כסו את הצלחת ברדידי פלסטיק שקופים ונצמדים מעצמם התואמים למיקרו-צלחות פוליפרופילן.<ol><li>הכן את הריכוז העליון עם מאגר ללא DMSO כדי להבטיח DMSO של 2% בריכוז הסופי. ל- 147 μL של מאגר ללא DMSO, הוסף 1.5 μL של מלאי MZ1 ב- 1 mM ו- 1.5 μL של 100% DMSO.</li>
			<li>הכן את הדילול הטורי פי 3 עם מאגר ריצה המכיל 2% DMSO. ל 100 μL של חיץ הריצה, להוסיף 50 μL של תמיסה בריכוז העליון מוכן בשלב 3.1.3.1, ולערבב היטב כדי להכין את הריכוזהשני הגבוה ביותר.</li>
			<li>לאחר מכן להעביר 50 μL של הפתרון מוכן בשלב 3.1.3.2 הבא 100 μL של חיץ ריצה, לערבב היטב כדי להכין את הריכוז הגבוה ביותר3 , וכן הלאה.</li>
		</ol></li>
		<li>הפעל SPR באמצעות ההגדרה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 120 שניות; זמן דיסוציאציה: 300 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה.</li>
		<li>בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ההערכה שסופקה על-ידי יצרן המכשיר. ניתוח מצב יציב הצביע על KD = 26 (± 3) nM ו- Rmax של ~91% (± 5%) קשירה שהושגה (איור 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR עבור VHL: MZ1: קומפלקס טרנרי Brd4BD2<ol><li>הכן את המאגר כמתואר בשלב 3.1.1.</li>
		<li>הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את VHL ל~ 100 RU. הזריקו תמיסת חלבון של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל VHL בקצב זרימה של 5 מיקרוליטר/דקה וזמן מגע בין 1-5 דקות עד להגעה לצפיפות פני השטח של ~100 RU.</li>
		<li>הכינו דגימות לשתי הזרקות חד-מחזוריות של 5 קפלים, 5 נקודות בפלטה תחתונה עגולה מפוליסטירן 96 באר, שקופה בנפח מרבי של 323 מיקרוליטר וכסו אותה ברדידי פלסטיק שקופים ונצמדים עצמיים התואמים למיקרו-צלחות פוליסטירן כמתואר בשלבים 3.2.3.1-3.2.3.2.<ol><li>שליטה שלילית: analyte מכיל Brd4BD2 בלבד.<ol><li>הכן ריכוז עליון של 25 מיקרומטר במאגר ריצה עם נפח של 200 μL (#A5)</li>
				<li>הוסף 160 μL כל אחד של Brd4BD2 ב 2 μM במאגר הריצה ל 4 הבארות הבאות משמאל (#A1-A4)</li>
				<li>העבר 40 μL של A5 ל- A4. מערבבים היטב.</li>
				<li>העבר 40 μL של A4 ל- A3. מערבבים היטב. המשך לעשות זאת עד A1.</li>
			</ol></li>
			<li>היווצרות מורכבת טרינרית: אנליט מכיל MZ1 ו- Brd4BD2.<ol><li>הכן את הריכוז העליון על ידי הוספת 4 μL של MZ1 ב- 20 μM בתמיסת 100%-DMSO ל- 196 μL המכילה 25.5 μM Brd4BD2 במאגר ללא DMSO (#B5). הריכוזים הסופיים הם 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 ו-2% DMSO.</li>
				<li>הוסף 160 μL כל אחד של Brd4BD2 ב 2 μM בחיץ ריצה ל 4 הבארות הבאות משמאל (#B1-B4)</li>
				<li>העבר 40 μL של B5 ל B4. מערבבים היטב.</li>
				<li>העבר 40 μL של B4 ל B3. מערבבים היטב. המשך לעשות זאת עד B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>הפעל SPR באמצעות הגדרת מחזור יחיד: זמן יצירת קשר: 100 שניות; זמן דיסוציאציה: 720 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. יש למרוח שלוש זריקות חיץ לפני כל דגימה כדי להבטיח רקע יציב.</li>
		<li>ניתוח נתונים: החל את ההזרקה השלישית של המאגר כרקע לחיסור. כבקרה שלילית, כאשר MZ1 אינו קיים, תגובת SPR בין VHL ו- Brd4BD2 היא זניחה. כאשר MZ1 קיים, התאמה קינטית מציינת את האינטראקציה בין VHL ו- MZ1-Brd4קומפלקס BD2 יש kעל = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1, ו- KD = 1 nM. (איור 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR עבור אינטראקציות CRBN ומולקולות קטנות<ol><li>הכנת חיץ.<ol><li>הכינו מאגר 1 ליטר המכיל 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5, והעבירו אותו דרך יחידת מסנן0.2 מיקרומטר.</li>
			<li>הסר 20 מ"ל של מאגר ומלא מחדש 20 מ"ל של 100% DMSO (2% DMSO במאגר ההפעלה הסופי). חשוב לשמור על DMSO בשיעור של 2% בכל הדגימות המתוארות להלן (שלבים 3.3, 3.4 ו-3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את CRBN ל~800 RU.</li>
		<li>הכינו תרכובות בדילול טורי פי 3, 6 נק' על צלחת 384 בארות עם ריכוז עליון של 30 מיקרומטר כמתואר ב-3.1.3.</li>
		<li>הפעל SPR באמצעות ההתקנה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים, זמן מגע: 60 שניות, זמן ניתוק: 90 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. עבור מערכת זו, שלוש זריקות חיץ מספיקות כדי לקבל רקע יציב. עבור מערכות בדיקה אחרות, ייתכן שיהיה צורך לבצע הזרקות מאגר נוספות.</li>
		<li>בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן. הערה: ניתוח מצב יציב מצביע על KD של BRD-2512 ו- BRD-5110 שניהם סביב 3 מיקרומטר. עם זאת, הקשירה הגיעה רק ל~ 70% Rקשירה מקסימלית בריכוז העליון. הן הזיקה החלשה והן צורת החיישן מצביעות על כך שסביר להניח שתתרחש אי-מסיסות מורכבת בריכוזים גבוהים. לפיכך, KD בפועל עשוי להיות גבוה מ -3 מיקרומטר. BRD-4761, שאינו נקשר ל- CRBN, נכלל כבקרה שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR עבור אינטראקציות PPM1D ומולקולות קטנות<ol><li>הכן מאגר כמתואר בשלב 3.3.1. השתמש בשבב חיישן חומצה ניטרילואצטית (NTA).</li>
		<li>החל מחזור יחיד מכיוון שלראש הקרב PPM1D יש k מופעל ו-kכבוי איטי. צור מחדש את שבב NTA באמצעות הגדרת ברירת המחדל של היצרן ושתק PPM1D ל~ 1000 RU לאחר כל הזרקת תרכובת (הזרקת תמיסת חלבון של 5 מיקרוגרם / מ"ל ב 5 מיקרוליטר / דקה).</li>
		<li>הכינו תרכובות בדילול טורי פי 3, 5 נקודות עם ריכוז עליון של 400 ננומטר כמתואר ב-3.1.3.</li>
		<li>הפעל SPR באמצעות הגדרת מחזור יחיד: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 90 שניות; זמן דיסוציאציה: 600 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה. יש למרוח שלוש זריקות חיץ לפני כל תרכובת כדי להבטיח רקע יציב.</li>
		<li>ניתוח נתונים. החל את הזריקה השלישית של המאגר כרקע לחיסור. כבקרה השלילית, BRD-2512 אינו מראה מחייב ל- PPM1D. עבור BRD-4761 ו- BRD-5110, התאמה קינטית הצביעה על KD עבור שניהם להיות 1-2 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR עבור CRBN:PROTAC: קומפלקס טרנרי PPM1D<ol><li>הכן מאגר כמתואר בשלב 3.3.1.</li>
		<li>הפעל את שבב SA בהתאם לפרוטוקול היצרן והשתק את CRBN ל~35 RU (הזריק תמיסת חלבון של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-5 מיקרוליטר/דקה).</li>
		<li>הכן שלוש תרכובות בדילול טורי פי 3, 6 נקודות עם ריכוז עליון של 30 מיקרומטר תוך שמירה על [PPM1D] על 1 מיקרומטר בכל הדגימות, כולל ריקות, באמצעות השיטה המתוארת בשלב 3.2.3.</li>
		<li>הפעל SPR באמצעות ההגדרה מרובת המחזורים: מצב: ביצועים גבוהים; זמן יצירת קשר: 60 שניות; זמן דיסוציאציה: 90 שניות; קצב זרימה: 50 מיקרוליטר/דקה.</li>
		<li>בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת היצרן. הערה: בעוד BRD-2512 ו-BRD-4761 מראים תגובה אפסית/זניחה, BRD-5110 מראה בבירור את "אפקט הוו" במצב יציב עם קינטיקה של הפעלה/כיבוי מהירים (איור 5A-C). תגובת הקישור הניסיונית מ-BRD-5110 (איור 5C) נמצאת בין התגובה החזויה מהסימולציה כאשר מניחים ש-KD (CRBN, cpd) הוא 3 או 10 מיקרומטר (איור 5E), מה שמרמז על כך ש-K D הטרינרי ו-KD הבינארי דומים מאוד. אין שיתוף פעולה נראה לעין של PPM1D: BRD-5110: היווצרות קומפלקס CRBN.</li>
	</ol></li>
</ol>

אפיון היווצרות קומפלקס טרינרי בפרוטאקים באמצעות בדיקות ביופיזיקליות

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome.">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li><li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy.">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li><li>Toure, M., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+PROTACS:+New+approaches+to+protein+degradation.">Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation.</a> Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).</li><li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation.">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li><li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

אפיון ביופיזי של יחסי הגומלין הבינאריים והטרינריים בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים יכול לספק תובנות ייחודיות ומשלימות ביחס למערכות תאיות בשימוש נרחב. הבנת הזיקה בין כל ראש קרב של מולקולת PROTAC לבין שותפיה קושרי החלבונים יכולה לעזור להנחות את מאמצי הכימיה הרפואית לקראת או...

polyubiquitination של חלבונים בתא הוא תהליך מווסת היטב המערב אנזימים ממשפחת Ubiquitin Ligase 1,2. האנזימים הסופיים במסלול הם ליגאזות יוביקוויטין E3 המצמידות באופן קוולנטי מולקולות יוביקוויטין לשותפיהן קושרי החלבונים3. הפוליוביקוויטינציה של אותם שותפים קושרי חלבונים מכוונת אותם לפירוק פרוטאוליטי על ידי פרוטאזום4. מערכת זו היא חלק מתהליך הומאוסטזיס חלבונים אשר מונף טיפולית כדי לגרום לפירוק של חלבונים המעורבים במחלה5. מולקולות קטנות הגורמות לאינטראקציה בין ליגאזות יוביקוויטין E3, כגון Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) או cereblon (CRBN), מורכבות בדרך כלל מראש קרב קושר ליגאז E3 המחובר על ידי מקשר גמיש לראש קרב שנקשר לחלבון המיועד לפירוק. מולקולות הטרוביפונקציונאליות אלה מכונות בדרך כלל פרוטאוליזה המכוונת לכימרות או פרוטאקים6.
הפיתוח של PROTACS כרוך בהערכת היכולת של מולקולות לגרום לפירוק של חלבונים בתאים. פותחו מערכות בדיקה תאיות רבות המנטרות את האינטראקציה המושרה בין חלבון המטרה לבין רכיבי ליגאז E3, כגון VHL או CRBN, בעת הטיפול בתאים במולקולת PROTAC. ניסוי תאי אחד כזה, מערכת ננולוק-הלוטג7, כולל ליגאז E3 המאוחה למקבל ההלוטאג וחלבון מטרה המתויג עם תורם ננולוק. היווצרות מורכבת טרינרית מביאה את תורם ננולוק ומקבל הלוטג לקרבה ומאפשרת העברת אנרגיה מהתורם למקבל וכתוצאה מכך פליטת אור. ניתן להשתמש בווריאציות של מערכת זו כדי להעריך את החדירות התאית של מולקולות PROTACS8 או שינויים ברמה היחסית של יוביקוויטינציה של חלבון המטרה9. בעוד שמערכות תאיות אלה חיוניות להנעת אופטימיזציה של PROTACS, היווצרות קומפלקסים בין ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק היא תהליך רב-שלבי10,11. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות הבינאריות והטרינריות המעורבות תורמות ליעילות יוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון12,13,14.
להלן מתוארים פרוטוקולים שניתן להתאים לאפיון ביופיזי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTACS באמצעות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC). פרוטוקולי SPR ו-ITC עבור מולקולת MZ1 PROTAC הגורמת להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL שנגזרו מדוחות ספרות13,15 ומתוארים כאן הצליחו לשחזר את התוצאות המדווחות עם שינוי מסוים של ההליכים המדווחים, אשר יידונו. תיאור של בדיקת BLI המשמשת להערכת היווצרות מורכבת טרינרית בין MZI, Brd4BD2 ו- VHL נכלל בדוח זה. מדידות הזיקה מ-BLI היו עקביות עם אלה שנצפו ב-SPR וב-ITC. פרוטוקול שפורסם בעבר ובו פותחה בדיקת SPR להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC בין PPM1D, חלבון Ser/Thr פוספטאז שביטויו מושרה באופן תלוי p5316, לבין CRBN מתואר גם כן. במקרה זה, למולקולת PROTAC יש זיקה ננו-מולרית ל-PPM1D אך רק זיקה מיקרומולרית ל-CRBN. במקרה זה, הקישור של מולקולת PROTAC ל-CRBN אינו רווי, וכתוצאה מכך נוצר "אפקט הוו" הנפוץ. אפקט הקרס הוא תכונה של שלוש מערכות גוף שבהן ישנם שני מינים שיכולים ליצור קומפלקס הטרוטרימרי כאשר שניהם קשורים למולקולת גישור (איור 1)17. אפקט הקרס נצפה כאשר המין המגשר נמצא בריכוז עודף ביחס לשני המינים האחרים. המצב המתקבל הוא מצב שבו האינטראקציות הבינאריות עולות על האינטראקציות הטרינריות. המערכות שבהן נצפה אפקט הוו דורשות שיקולי תכנון ניסוייים ספציפיים שנדונו בדו"ח זה. מושגים כלליים ודרישות מגיב להערכת השימוש בבדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC מסופקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק יכולים להיווצר קומפלקסים על ידי מולקולות הטרוביפונקציונאליות בתהליך רב-שלבי. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות המעורבות תורמות ליעילות היוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון. טכניקות ביופיזיקליות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) מספקות מידע רב ערך שניתן להשתמש בו באופטימיזציה של אינטראקציות אלה. באמצעות שתי מערכות מודל, הוקמה ערכת כלים לבדיקה ביופיזית להבנת הקואופרטיביות של היווצרות מרוכבים טרינריים והשפעת "אפקט הוו" על קינטיקה קשירה. במקרה אחד, נבדקה מולקולת פרוטאוליזה המכוונת לכימרה (PROTAC) שגרמה להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, MZ1, יש זיקות nM הן לחלבון Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) והן לקומפלקס VHL (SPR KD = 29 nM, itc k d = 66 nM). עבור מערכת זו, פותחו מבחני SPR, BLI ו- ITC חזקים ששיחזרו תוצאות שפורסמו המדגימות את הקואופרטיביות של היווצרות מורכבת טרינרית. במקרה השני, נחקרה מולקולה שגרמה לקומפלקסים טרינריים בין חלבון 46.0 kDa PPM1D וצרבלון [CRBN (319-442)]. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, BRD-5110, יש SPR K D = 1 ננומטר עבור PPM1D אך קשירה חלשה בהרבה כנגד קומפלקס CRBN קטוע (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). במקרה זה, הכריכה עבור CRBN ב- SPR לא הייתה רוויה, וכתוצאה מכך נוצר "אפקט וו". הוערכו דרישות התפוקה והמגיבים עבור SPR, BLI ו-ITC, וניתנו המלצות כלליות ליישומן בפרויקטים של PROTAC.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

מחבר זרקור: הערכת בדיקות ביופיזיקליות לאפיון קומפלקסים טרינריים PROTACS 

פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

אפיון של VHL: קומפלקס בינארי MZ1 ו-VHL: MZ1: Brd4BD2 terary complex ניתן למצוא באיור 2 (ITC), איור 3 (BLI) ואיור 4 (SPR) באמצעות מאגר דומה מאוד. ה- KD המופק מבדיקות אורתוגונליות הוא עקבי. הקואופרטיביות יכולה להיות מחושבת על ידי K D (בינארי) / KD (טרינר...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN). שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

המחקר שלנו מתמקד בשכפול מערכות מודל מבוססות, תיקוף שלהן באמצעות בדיקות נוספות והתאמת מתודולוגיות אלה להקשר המחקר הספציפי שלנו. אנו שואפים להדגים גישה מגוונת שניתן ליישם בפרויקטים שונים. האתגר הניסיוני הנוכחי, רישוי בחירה אסטרטגית של פורמט הבדיקה והתנאים המתאימים בהתבסס על דרישות ספציפיות לפרויקט ופערי ידע קיימים.זה חיוני להשגת תשובות יעילות ומדויקות בניסויים שלנו. הפרוטוקול שלנו מספק גישה יעילה להתאמה חלקה למערכות ProTech שונות. יתר על כן, אנו מבצעים הערכה יסודית של כל שיטה, תוך הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם.אנו מציעים הוראות מושכלות לבחירת הפורמט המתאים ביותר בהתבסס על תנאים ספציפיים.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K Views.  The Broad Institute of MIT and Harvard. המחקר שלנו מתמקד בשכפול מערכות מודל מבוססות, תיקוף שלהן באמצעות בדיקות נוספות והתאמת מתודולוגיות אלה להקשר המחקר הספציפי שלנו. אנו שואפים להדגים גישה מגוונת שניתן ליישם בפרויקטים שונים. האתגר הניסיוני הנוכחי, רישוי בחירה אסטרטגית של פורמט הבדיקה והתנאים המתאימים בהתבסס ?...

Video: מחבר זרקור: הערכת בדיקות ביופיזיקליות לאפיון קומפלקסים טרינריים PROTACS 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).