이 연구는 MIT와 하버드의 브로드 연구소(Broad Institute of MIT and Harvard)의 치료제 개발 센터(Center for the Development of Therapeutics)의 혁신 및 기술 개발 상(Innovation and Technology Development Award)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업을 지원해 준 고위 경영진과 검토 위원회의 구성원들에게 감사의 뜻을 전한다.

모든 단백질은 문헌 프로토콜18에 따라 우수한 수율과 순도(>80%)로 대장균에서 과발현되었습니다. 비오틴화는 BirA-촉매 반응18을 사용하여 수행하였다. 모든 저분자는 100% DMSO에서 1mM 원액으로 준비되었습니다. 여기에 설명된 절차에는 특수 실험실 안전 장비나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 표준 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다(예: 실험실 가운, 보안경 및 장갑).
이 연구에 적용된 단백질은 다음과 같습니다. VHL: ElonginB의 C-말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 VHL(53-213)/ElonginB(1-104)/ElonginC(17-112) 복합체. Brd4BD2: 태그가 지정되지 않은 Brd4BD2(333-460) CRBN: N 말단에 Avi-tag가 있는 비오틴화된 CRBN(319-442) PPM1D: N 말단에서 태그가 지정되지 않은 이중 또는 이중 His8 태그가 지정된 PPM1D(1-420)
이 연구에 적용된 소분자는 다음과 같습니다. MZ1 (MW = 1002.6 Da): VHL 및 Brd4BD2에 결합하는 PROTAC BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBNKD ~ 3 μM, PPM1D에 결합하지 않음 BRD-5110 (MW = 872.0 Da) : CRBNKD ~ 3 μM, PPM1DKD = 1-2 nM BRD-4761(MW = 476.6Da): CRBN, PPM1DKD = 1-2nM에 결합하지 않음
1. 방법 1: ITC(등온 적정 열량계)
참고: 적정은 자동 주입 기능이 있는 마이크로 열량계를 사용하여 수행됩니다.
<ol><li>완충액 준비: 20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, pH 7.5를 포함하는 완충액 3L를 준비합니다.</li>
	<li>투석: VHL 및 Brd4BD2 (각각 150μM에서 ~ 500μL)를 단계 1.1에서 제조한 완충액 1L에 대해 4°C에서 3회, 각각 4시간, 2시간 및 약 16시간 동안 투석합니다. 마지막 투석 후 후속 단계에서 사용할 수 있도록 완충액을 저장합니다.</li>
	<li>플라스틱 덮개가 있는 96웰 플레이트에 샘플을 준비합니다.<ol><li>각 적정에 대해 셀용 용액 400μL, 주사기용 용액 125μL, 세척용 완충액 400μL를 준비합니다. 플레이트의 연속된 웰 3개에 샘플을 추가합니다. 화합물 스톡은 100% DMSO에서 1mM으로 준비되므로 단백질 용액에 동일한 비율의 DMSO를 첨가하여 세포와 주사기의 완충액이 일치하도록 합니다. 최종 용액에 2% DMSO를 추가합니다.<ol><li>VHL을 MZ1로 적정하기 위한 샘플: 392μL의 완충액, 1mM(10μM 최종 농도)에서 4μL의 MZ1 및 4μL의 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM에서 122.5μL의 VHL, 2.5μL의 100% DMSO(84μM 최종 농도)를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
			<li>VHL을 완충액으로 적정하기 위한 샘플(데이터는 샘플 1.3.1.1에서 생성된 데이터의 백그라운드 빼기에 사용됨): 392μL 완충액, 8μL 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(최종 농도 84μM)에서 122.5μL의 VHL을 포함하는 주사기 용액을 준비하고 2.5μL의 100% DMSO를 추가합니다.</li>
			<li>VHL을 MZ1 및 Brd4 BD2로 적정하기 위한 샘플: 17.1μM Brd4BD2(16.8μM 최종 농도) 392μL, 1mM(8.4μM 최종 농도)에서 MZ1 3.36μL 및 100% DMSO의 4.64μL를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(84μM 최종 농도)에서 122.5μL의 VHL과 2.5μL의 100% DMSO를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
			<li>VHL을 Brd4 BD2로 적정하기 위한 샘플(1.3.1.3의 배경): 392μL의 17.1μM Brd4BD2(16.8μM 최종 농도) 및 8μL의 100% DMSO를 포함하는 세포 용액을 준비합니다. 85.7μM(84μM 최종 농도)에서 122.5μL의 VHL과 2.5μL의 100% DMSO를 포함하는 주사기 용액을 준비합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>마이크로 열량계에서 4개의 적정을 모두 실행합니다. 각각은 120초 시간 간격으로 2μL/s의 속도로 2μL 주사기 용액을 19회 주입하는 것으로 구성됩니다. 단백질(0.4μL)을 초기에 주입하고 데이터 분석 중에 폐기합니다. 모든 실험은 25°C에서 600rpm으로 교반하면서 수행합니다.</li>
	<li>데이터 분석: 제조업체에서 제공한 분석 소프트웨어를 사용하여 화학량론(n), 해리 상수(KD) 및 결합 엔탈피(ΔH)를 얻기 위해 단일 결합 부위 모델에 데이터를 맞춥니다(그림 2).</li>
</ol>2. 방법 2: BLI(생물층 간섭계)
<ol><li>5Hz의 획득 속도로 실온(RT)에서 streptavidin(SA) 코팅 센서를 사용하여 BLI 실험을 수행합니다. 자동화된 BLI 실험 중에 센서가 단일 컬럼 내에 고정되어 있고 최대 웰 부피가 392μL인 96웰, 평평한 바닥, 흑색 플레이트의 다른 컬럼 사이를 이동하는지 확인합니다. 실험에 사용된 플레이트의 각 웰을 200μL의 용액으로 채웁니다. 참고: BLI는 단백질-단백질 상호 작용(즉, 삼원 복합체 형성)을 감지하는 데만 유용합니다. 단백질과 소분자 사이의 상호 작용을 감지할 만큼 민감하지 않습니다.<ol><li>완충액 준비: 20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, 0.05% P20, pH 7.5를 포함하는 완충액 100mL를 준비합니다.</li>
		<li>고정 단계 최적화: 제조업체에서 권장하는 대로 테스트 센서를 1-3nm로 로드합니다. ~1.0nm의 하중이 여기에 설명된 절차에 사용됩니다. 이를 위해 센서를 1.5μg/mL의 VHL이 포함된 용액에 80초 동안 담그십시오.</li>
		<li>다음 시퀀스를 사용하여 7개의 SA 센서를 적용하여 BLI 역학 측정을 수행합니다.<ol><li>첫 번째 기준 단계의 경우 60초 동안 버퍼에 담급니다.</li>
			<li>고정화 단계의 경우 1.5μg/mL의 VHL 용액에 80초 동안 담그십시오.</li>
			<li>두 번째 기준 단계의 경우 60초 동안 버퍼에 담그십시오.</li>
			<li>결합 단계의 경우 2μM에서 고정 농도의 Brd4BD2 , 2%에서 고정 농도의 DMSO와 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.3nM, 3.1nM 및 0nM(기준 센서)에서 다양한 농도의 MZ1 용액에 300초 동안 담그십시오.</li>
			<li>해리 단계의 경우 600초 동안 버퍼에 담그십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 데이터 피팅을 위해 k on, koff 및 KD가 보고됩니다(그림 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 방법 3: SPR(표면 플라즈몬 공명)
참고: 모든 SPR 실험은 RT에서 스트렙타비딘(SA) 코팅 센서 칩을 사용하여 수행됩니다. NTA 칩은 단백질과 소분자 사이의 검출에 사용되지만, SA 칩보다 훨씬 더 높은 배경이 관찰되기 때문에 삼원 복합체에 적용할 때 하전된 칩 표면과 분석물 내 단백질 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 주의해서 사용해야 합니다.
<ol><li>VHL-MZ1 상호 작용을 위한 SPR<ol><li>완충액 준비.<ol><li>20mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, 0.005% P20, pH7.5를 포함하는 1L 완충액을 준비하고 0.2μm 필터 장치를 통과시킵니다.</li>
			<li>나중에 사용할 수 있도록 20mL의 완충액을 제거하고(DMSO 무함유 완충액) 20mL의 DMSO(최종 실행 완충액의 2% DMSO)로 다시 채웁니다. 아래에 설명된 모든 샘플에서 DMSO를 2%로 유지합니다(3.1 및 3.2단계).</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 VHL을 ~2000RU로 고정합니다(5μL/min에서 5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>최대 부피가 130μL인 384웰, 원뿔형 바닥, 반투명 폴리프로필렌 플레이트에서 상단 농도 10μM의 3겹, 8포인트 연속 희석으로 MZ1을 준비합니다. 폴리프로필렌 마이크로플레이트와 호환되는 자체 접착식 투명 플라스틱 호일로 플레이트를 덮습니다.<ol><li>최종 농도에서 2% DMSO를 보장하기 위해 DMSO가 없는 완충액으로 최고 농도를 준비합니다. 147μL의 DMSO-free 완충액에 1mM에서 1.5μL의 MZ1 스톡과 100% DMSO의 1.5μL를 추가합니다.</li>
			<li>2% DMSO를 함유한 러닝 버퍼로 3배 연속 희석액을 준비합니다. 러닝 버퍼 100μL에 3.1.3.1단계에서 제조한 최고 농도의 용액 50μL를 첨가하고 잘 혼합하여 2차 최고 농도를 제조한다.</li>
			<li>그런 다음 3.1.3.2 단계에서 제조한 용액 50μL를 다음 100μL의 러닝 버퍼로 옮기고 잘 혼합하여 3번째로 높은 농도를 제조하는 식입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간 : 120 초; 해리 시간: 300초; 유량: 50μL/min.</li>
		<li>기기 제조업체에서 제공하는 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 정상 상태 분석은 KD = 26 (± 3) nM 및 ~ 91 % (± 5 %) 결합의 Rmax가 달성되었음을 나타 냈습니다 (그림 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>VHL용 SPR: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체<ol><li>3.1.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 VHL을 ~100RU로 고정합니다. 0.5μg/mL VHL의 단백질 용액을 5μL/min의 유속으로 주입하고 표면 밀도가 ~100RU에 도달할 때까지 1-5분 사이의 접촉 시간을 주입합니다.</li>
		<li>최대 부피가 323μL인 96웰의 투명한 폴리스티렌 원형 바닥 플레이트에서 2회의 5겹, 5포인트 단일 사이클 주입을 위한 샘플을 준비하고 3.2.3.1-3.2.3.2단계에 설명된 대로 폴리스티렌 마이크로플레이트와 호환되는 접착식 투명 플라스틱 호일로 덮습니다.<ol><li>음성 대조군: 분석물에는 Brd4BD2 만 포함되어 있습니다.<ol><li>부피가 200μL(#A5)인 실행 버퍼에서 25μM의 최고 농도를 준비합니다.</li>
				<li>러닝 버퍼의 2μM에서 각각 160μL의 Brd4BD2 를 왼쪽의 다음 4웰(#A1-A4)에 추가합니다.</li>
				<li>40μL의 A5를 A4로 옮깁니다. 잘 섞는다.</li>
				<li>40μL의 A4를 A3로 옮깁니다. 잘 섞는다. A1까지 계속하십시오.</li>
			</ol></li>
			<li>삼원 복합체 형성: 분석물에는 MZ1 및 Brd4BD2가 포함되어 있습니다.<ol><li>DMSO-free 완충액(#B5)에 25.5μM Brd4BD2 를 포함하는 196μL에 100% DMSO 용액에서 20μM에서 4μL의 MZ1을 추가하여 최고 농도를 준비합니다. 최종 농도는 25μM Brd4BD2, 100nM MZ1 및 2% DMSO입니다.</li>
				<li>실행 중인 버퍼에서 2μM에서 각각 160μL의 Brd4BD2 를 왼쪽의 다음 4웰(#B1-B4)에 추가합니다.</li>
				<li>40μL의 B5를 B4로 옮깁니다. 잘 섞는다.</li>
				<li>40μL의 B4를 B3로 옮깁니다. 잘 섞는다. B1까지 계속하십시오.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>단일 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 접촉 시간: 100초; 해리 시간: 720초; 유량: 50μL/min. 안정적인 배경을 보장하기 위해 각 샘플 전에 완충액을 세 번 주입합니다.</li>
		<li>데이터 분석: 버퍼의 세 번째 주입을 빼기의 배경으로 적용합니다. 음의 대조군으로서 MZ1이 존재하지 않을 때 VHL과 Brd4BD2 사이의 SPR 응답은 무시할 수 있습니다. MZ1이 존재할 때, 키네틱 피팅은 VHL과 MZ1-Brd4사이의 상호작용이 k on = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1 및 KD = 1 nM임을 나타낸다. (그림 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>CRBN 및 저분자 상호작용을 위한 SPR<ol><li>완충액 준비.<ol><li>50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5mM TCEP, 0.005% P20, pH 7.5를 포함하는 1L 완충액을 준비하고 0.2μm 필터 장치를 통과시킵니다.</li>
			<li>20mL의 완충액을 제거하고 20mL의 100% DMSO를 다시 채웁니다(최종 실행 중인 완충액에서 2% DMSO). 아래에 설명된 모든 샘플에서 DMSO를 2%로 유지하는 것이 중요합니다(3.3, 3.4 및 3.5단계).</li>
		</ol></li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 CRBN을 ~800RU로 고정합니다.</li>
		<li>3.1.3에 설명된 대로 최고 농도가 30μM인 384웰 플레이트에서 3겹, 6pt 연속 희석으로 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능, 접촉 시간: 60초, 해리 시간: 90초; 유량: 50μL/min. 이 시스템의 경우 안정적인 백그라운드를 얻기 위해 세 번의 버퍼 주입으로 충분합니다. 다른 분석 시스템의 경우 추가 완충액 주입을 수행해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 알림: 정상 상태 분석에 따르면 BRD-2512 및 BRD-5110의 KD는 모두 약 3μM입니다. 그러나, 결합은 최고 농도에서만 ~ 70% R최대 결합을 도달했습니다. 약한 친화도와 센서그램의 모양은 모두 고농도에서 화합물 불용성이 발생할 가능성이 있음을 나타냅니다. 따라서,실제 KD 는 3μM보다 높을 수 있다. CRBN에 결합하지 않는 BRD-4761은 음성 대조군으로 포함되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>PPM1D 및 저분자 상호작용을 위한 SPR<ol><li>3.3.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다. 니트릴로아세트산(NTA) 센서 칩을 사용하십시오.</li>
		<li>PPM1D 탄두에는 느린 k켜기 와 끄기가 있으므로 단일 사이클을 적용하십시오. 제조업체의 기본 설정을 사용하여 NTA 칩을 재생하고 각 화합물 주입 후 PPM1D를 ~ 1000RU로 고정합니다(5μL/min에서 5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>3.1.3에 설명된 대로 최고 농도가 400nM인 3겹, 5점 연속 희석으로 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>단일 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간 : 90 초; 해리 시간: 600초; 유량: 50μL/min. 안정적인 백그라운드를 보장하기 위해 각 화합물 전에 완충액을 3회 주입합니다.</li>
		<li>데이터 분석. 버퍼의 세 번째 주입을 빼기의 배경으로 적용합니다. 음성 대조군인 BRD-2512는 PPM1D에 대한 결합을 나타내지 않습니다. BRD-4761 및 BRD-5110의 경우 키네틱 피팅은 둘 다에 대한 KD를 1-2nM으로 표시했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>CRBN:PROTAC에 대한 SPR: PPM1D 삼원 복합체<ol><li>3.3.1단계에 설명된 대로 버퍼를 준비합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 SA 칩을 활성화하고 CRBN을 ~35RU로 고정합니다(5μL/min에서 0.5μg/mL의 단백질 용액 주입).</li>
		<li>3.2.3단계에 설명된 방법을 사용하여 블랭크를 포함한 모든 샘플에서 [PPM1D]를 1μM로 유지하면서 최고 농도가 30μM인 3겹, 6점 연속 희석으로 3개의 화합물을 준비합니다.</li>
		<li>다중 주기 설정을 사용하여 SPR 실행: 모드: 고성능; 접촉 시간: 60초; 해리 시간: 90초; 유량: 50μL/min.</li>
		<li>제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 알림: BRD-2512 및 BRD-4761은 반응이 없거나 무시할 수 있는 반면 BRD-5110은 빠른 온/오프 역학으로 정상 상태에서 "후크 효과"를 명확하게 보여줍니다(그림 5A-C). BRD-5110의 실험적 결합 반응(그림 5C)은 KD(CRBN, cpd)가 3 또는 10μM(그림 5E)라고 가정할 때 시뮬레이션에서 예측된 반응 사이에 있으며, 이는 삼항 KD와 이진KD가 매우 유사하다는 것을 시사합니다. PPM1D: BRD-5110: CRBN 복합체 형성의 명백한 협력성은 없습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Biophysical Assay를 사용한 PROTAC의 삼원 복합체 형성 특성 분석

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 및 삼원 상호 작용에 대한 생물물리학적 특성 분석은 널리 사용되는 세포 시스템과 관련하여 독특하고 보완적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. PROTAC 분자의 각 탄두와 단백질 결합 파트너 간의 친화도를 이해하면 이러한 상호 작용을 최적화하기 위한 의약 화학 노력을 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 발표된 삼원 PROTAC 복합체의 결정 구조는...

세포 내 단백질의 폴리유비퀴틴화는 유비퀴틴 리가아제 계열의 효소를 포함하는 엄격하게 조절되는 과정입니다 1,2. 이 경로의 말단 효소는 유비퀴틴 분자를 단백질 결합 파트너에 공유 결합하는 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이다3. 이러한 단백질 결합 파트너의 폴리유비퀴틴화는 프로테아좀4에 의한 단백질 분해를 표적으로 합니다. 이 시스템은 질병에 관여하는 단백질의 분해를 유도하기 위해 치료적으로 활용된 단백질 항상성 과정의 일부이다5. Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 또는 세레블론(CRBN)과 같은 E3 유비퀴틴 리가아제 간의 상호작용을 유도하는 소분자는 일반적으로 분해 표적이 되는 단백질에 결합하는 탄두에 유연한 링커에 의해 연결된 E3 리가아제 결합 탄두로 구성됩니다. 이러한 이종이기능성 분자는 일반적으로 키메라 또는 PROTACS6를 표적으로 하는 단백질 분해라고 합니다.
PROTACS의 개발에는 세포 내 단백질의 분해를 유도하는 분자의 능력 평가가 포함됩니다. PROTAC 분자로 세포를 처리할 때 표적 단백질과 E3 리가아제 성분(예: VHL 또는 CRBN) 간의 유도된 상호 작용을 모니터링하는 많은 세포 분석 시스템이 개발되었습니다. 이러한 세포 분석 중 하나인 nanoluc-Halotag 시스템7은 Halotag 수용체에 융합된 E3 리가아제와 나노루크 공여체로 태그된 표적 단백질을 포함합니다. 삼원 복합체 형성은 nanoluc 공여체와 Halotag 수용체를 근접하게 하여 공여체에서 수용체로 에너지를 전달하여 빛을 방출합니다. 이 시스템의 변형은 PROTACS 분자8의 세포 투과성 또는 표적 단백질 유비퀴틴화9의 상대적 수준의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 시스템은 PROTACS의 최적화를 유도하는 데 필수적이지만, E3 리가아제와 분해 표적 단백질 사이의 복합체 형성은 다단계 과정입니다10,11. 관련된 이원 및 삼원 상호 작용의 동역학 및 열역학은 효율성 유비퀴틴화와 단백질12,13,14의 결과적인 분해에 기여합니다.
본 명세서에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 PROTACS에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성화에 적응할 수 있는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 문헌 보고(13,15)로부터 유래되고 여기에 기술된 Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 MZ1 PROTAC 분자에 대한 SPR 및 ITC 프로토콜은 보고된 절차의 일부 수정을 통해 보고된 결과를 요약할 수 있었으며, 이에 대해 논의될 것이다. MZI, Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 평가하는 데 사용되는 BLI 분석에 대한 설명이 이 보고서에 포함되어 있습니다. BLI의 친화도 측정은 SPR 및 ITC에서 관찰된 것과 일치했습니다. p53 의존적 방식으로 발현이 유도되는 Ser/Thr 단백질 인산가수분해효소인 PPM1D와 CRBN 사이의 PROTAC 유도 삼원 복합체 형성을 평가하기 위해 SPR 분석이 개발된 이전에 발표된 프로토콜도 설명됩니다. 이 경우 PROTAC 분자는 PPM1D에 대해 나노몰 친화도를 갖지만 CRBN에 대해서는 마이크로몰 친화도만 갖습니다. 이 경우 CRBN에 대한 PROTAC 분자의 결합은 포화되지 않아 일반적으로 관찰되는 "후크 효과"가 발생합니다. 갈고리 효과(hook effect)는 두 종이 모두 가교 분자에 결합될 때 이종 삼합체 복합체를 형성할 수 있는 세 가지 신체 시스템의 특성입니다(그림 1)17. 갈고리 효과는 가교 종이 다른 두 종에 비해 과도하게 집중되어 있을 때 관찰됩니다. 결과 상태는 이항 상호 작용이 삼항 상호 작용을 능가하는 상태입니다. 후크 효과가 관찰되는 시스템에는 이 보고서에서 논의된 특정 실험 설계 고려 사항이 필요합니다. PROTAC 유도 삼원 복합체 형성 평가를 위한 생물물리학 분석의 활용을 평가하기 위한 일반 개념 및 시약 요구 사항이 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

분해를 표적으로 하는 E3 리가아제와 단백질은 다단계 공정에서 이종 이작용 분자에 의해 복합체를 형성하도록 유도될 수 있습니다. 관련된 상호 작용의 역학 및 열역학은 유비퀴틴화의 효율성과 결과적으로 단백질의 분해에 기여합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 생물물리학 기술은 이러한 상호 작용의 최적화에 사용할 수 있는 귀중한 정보를 제공합니다. 두 가지 모델 시스템을 사용하여 삼원 복합체 형성의 협력성과 결합 역학에 대한 '후크 효과'의 영향을 이해하기 위한 생물물리학 분석 도구 키트를 확립했습니다. 한 사례에서, Brd4BD2와 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTAC) 분자를 평가하였다. 이종 이작용 분자 MZ1은 Brd4BD2 단백질(SPR KD = 1nM, ITC K D = 4nM)과 VHL 복합체(SPRKD = 29nM, ITC K D = 66nM) 모두에 대해 nM 친화도를 갖습니다. 이 시스템을 위해 삼원 복합체 형성의 협력성을 입증하는 발표된 결과를 재현하는 강력한 SPR, BLI 및 ITC 분석이 개발되었습니다. 다른 경우에는 46.0kDa 단백질, PPM1D 및 세레블론[CRBN(319-442)] 사이의 삼원 복합체를 유도하는 분자를 연구했습니다. 이종 이작용 분자인 BRD-5110은 PPM1D에 대해 SPR KD = 1nM이지만 잘린 CRBN(319-442) 복합체(SPR KD= ~ 3μM)에 대한 결합은 훨씬 약합니다. 이 경우 SPR에서 CRBN에 대한 바인딩이 포화 상태가 아니므로 "후크 효과"가 발생했습니다. SPR, BLI 및 ITC에 대한 처리량 및 시약 요구 사항을 평가하고 PROTAC 프로젝트에 적용하기 위한 일반적인 권장 사항을 제공했습니다.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

저자 스포트라이트: PROTACS 삼원 복합체 특성화를 위한 생물물리학 분석 평가 

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

VHL: MZ1 이원 복합체 및 VHL: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체의 특성 분석은 매우 유사한 버퍼를 사용하여 그림 2(ITC), 그림 3(BLI) 및 그림 4(SPR)에서 찾을 수 있습니다. 직교 분석에서 추출한 KD는 일관성이 있습니다. 협력성은 K D (이진) / KD (삼항)로 계산할 수 있으며, 이는 매우 양수 (ITC에서 15 또는 SPR에서 26)입...

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여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

우리의 연구는 확립된 모델 시스템을 복제하고, 추가 분석을 통해 검증하고, 특정 연구 맥락에 맞게 이러한 방법론을 조정하는 데 중점을 둡니다. 다양한 프로젝트에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식을 시연하는 것을 목표로 합니다. 현재의 실험적 과제는 프로젝트별 요구 사항 및 기존 지식 격차에 따라 적절한 분석 형식과 조건을 전략적으로 선택하는 라이센싱입니다.이는 실험에서 효율적이고 정확한 답을 얻는 데 필수적입니다. 당사의 프로토콜은 다양한 ProTech 시스템에 원활하게 적응할 수 있도록 간소화된 접근 방식을 제공합니다. 또한 각 방법에 대한 철저한 평가를 수행하여 각각의 장단점을 강조합니다.특정 조건에 따라 가장 적합한 형식을 선택하는 방법에 대한 정보에 입각한 지침을 제공합니다.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K 조회수.  The Broad Institute of MIT and Harvard. 우리의 연구는 확립된 모델 시스템을 복제하고, 추가 분석을 통해 검증하고, 특정 연구 맥락에 맞게 이러한 방법론을 조정하는 데 중점을 둡니다. 다양한 프로젝트에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식을 시연하는 것을 목표로 합니다. 현재의 실험적 과제는 프로젝트별 요구 사항 및 기존 지식 격차에 따라 적절한 분석 형식과 조건을 전략적으로 선택하는 라이센싱입니다...