Este trabajo contó con el apoyo de una beca de la NSF (2152065) y un premio NSF CAREER (1846857). Los autores desean agradecer a todos los miembros actuales y pasados del Laboratorio Wachs por contribuir a este protocolo. Los diagramas de la Figura 1 se realizaron en Biorender.

La cosecha de DRG se realizó de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Nebraska-Lincoln. Para el estudio se utilizaron ratas hembra Sprague Dawley de 12 semanas (~250 g). Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Fabricación y montaje de dispositivos multicompartimentos
<ol><li>Diseño asistido por ordenador e impresión 3D del dispositivo multicompartimento NOTA: El dispositivo MC consta de tres compartimentos para el aislamiento de cuerpos celulares DRG y neuritas (Figura 2A). El dispositivo MC no está disponible comercialmente; sin embargo, el archivo STL se proporciona aquí (Archivo de codificación suplementario 1) para permitir la impresión 3D. La impresión del MC tarda un (1) día en completarse.</li>
	<li>Sube el archivo STL del MC a una impresora 3D de resina utilizando un software compatible. NOTA: El material ideal para la impresión es una resina de alta temperatura. Una ventaja clave de usar resina de alta temperatura es que es biocompatible y se puede esterilizar en autoclave y reutilizar. También se puede utilizar una impresora 3D de procesamiento digital de luz (DLP) u otras impresoras 3D para imprimir el dispositivo.</li>
	<li>Transfiera los dispositivos impresos a una solución de lavado durante 30 minutos en isopropanol (>96%) para eliminar la resina residual de la superficie del dispositivo MC impreso.</li>
	<li>Fotocure los dispositivos a 80 °C durante 120 min utilizando un agente de curado disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales). El agente de curado mejora las propiedades mecánicas del dispositivo MC impreso al exponerlo a la temperatura y a los rayos UV.</li>
	<li>Cura térmicamente los dispositivos MC en un horno a 160 °C durante 180 min.</li>
	<li>Esterilice los dispositivos utilizando un autoclave durante 45 minutos en un ciclo de gravedad.</li>
</ol>2. Preparación del hidrogel
<ol><li>Sintetizar ácido hialurónico metacrilato (MAHA, metacrilación 85%-115%) y caracterizar mediante un protocolo descrito por Seidlits et al.20. NOTA: Para apoyar el crecimiento de DRG, se usan comúnmente hidrogeles triples compuestos de ácido hialurónico metacrilato, colágeno tipo I y laminina. Los resultados indican que los GRD crecen comúnmente en MAHA, oscilando entre 1,25 y 2,5 mg/mL y el colágeno entre 2,0 y 4,5 mg/mL. En el caso de la laminina, se ha comprobado que 0,75 mg/mL es suficiente para garantizar un crecimiento robusto de los GRD. En este artículo, se detallan los métodos para crear un gel triple con 1,25 mg/mL de MAHA, 4,5 mg/mL de colágeno y 0,75 mg/mL de laminina. La preparación del hidrogel debe realizarse en una cabina de flujo laminar para proporcionar un espacio de trabajo aséptico.</li>
</ol>3. Preparación de la solución del fotoiniciador
NOTA: Es necesario un fotoiniciador para la reticulación del MAHA bajo luz ultravioleta. Se utiliza habitualmente en porcentajes de 0,3% a 0,6%.
<ol><li>Prepare la solución fotoiniciadora 3 días antes de la cosecha de DRG.</li>
	<li>Precalentar el baño de agua sonicante a 37 °C antes de preparar la solución del fotoiniciador.</li>
	<li>Trabajando con la técnica estéril en una campana de flujo, prepare una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) de 23,125 mg/mL disolviendo NaHCO3 en 5 veces la solución Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES de Dulbecco.</li>
	<li>En un vial de vidrio, mezcle el fotoiniciador al 0,6 % en peso/volumen (p/v) en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) al 20 % vol/vol 1x y una solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril al 80 % vol/vol 5x.</li>
	<li>Para protegerlo de la luz, envuelva el frasco de vidrio en papel de aluminio. Sin embargo, asegúrese de retirar el papel de aluminio antes de transferir el vial al baño de agua de sonicación calentado a 37 °C con sonicación entre 30 y 40 min. NOTA: La solución del fotoiniciador debe protegerse de la luz porque puede descomponerse en radicales e iniciar el proceso de polimerización cuando se expone a la luz21.</li>
	<li>Filtre la solución estéril con un filtro de jeringa de 0,22 μm en un nuevo vial de vidrio estéril.</li>
</ol>4. Disolución de ácido hialurónico metacrilato
<ol><li>Disolver el ácido hialurónico metacrilato (preparado en el paso 2) el mismo día que se prepara la solución fotoiniciadora (paso 3).</li>
	<li>Coloque el MAHA liofilizado congelado en un desecador durante 15 minutos para que alcance la temperatura ambiente.</li>
	<li>Trabajando en una campana de flujo laminar y utilizando la técnica de pesaje estéril, pese el MAHA liofilizado en un vial de vidrio.</li>
	<li>Añada a MAHA el volumen necesario de solución de fotoiniciador filtrada para alcanzar la concentración deseada de MAHA. La concentración final común de gel es de 1,25 mg/mL de MAHA y 4,5 mg/mL de colágeno.</li>
	<li>Selle la tapa con una película de sellado de laboratorio, envuelva el frasco de vidrio con papel de aluminio y colóquelo en una placa agitadora orbital a temperatura ambiente hasta que se disuelva por completo (generalmente 3 días). De vez en cuando, vórtice la solución para separar grandes grupos de MAHA para garantizar una disolución uniforme de MAHA.</li>
</ol>5. Montaje del dispositivo
<ol><li>Coloque el dispositivo MC en una placa de 48 pocillos un día antes de la cosecha de DRG.</li>
	<li>Aplique una línea delgada de gel de silicona en la ranura debajo del dispositivo MC (Figura 2B) con una jeringa de 3 ml. Esto ayudará a que el dispositivo se adhiera de forma segura a la placa del pocillo.</li>
	<li>Con la ayuda de las pinzas #3, coloque suavemente el dispositivo MC en el pocillo de una placa de 48 pocillos, como se muestra en la Figura 2C. NOTA: El tamaño del dispositivo se puede modificar para adaptarse a la aplicación prevista, y se puede usar una placa de un tamaño diferente si se desea. Los dispositivos se pueden reutilizar. Para reutilizarlo, el hidrogel debe lavarse suavemente de todos los túneles, y la ranura de carga debajo del dispositivo debe usarse con etanol al 70% con agitación suave. Una vez completado, los dispositivos se pueden volver a esterilizar en autoclave antes de su uso.</li>
</ol>6. Preparación animal
<ol><li>Autoclave todas las herramientas de disección necesarias antes del inicio de la cosecha.</li>
	<li>Consigue una rata Sprague Dawley macho o hembra adulta de 12 a 20 semanas. El sexo de la rata no afecta el crecimiento de la GRD.</li>
	<li>Eutanasia de la rata de acuerdo con el protocolo aprobado de la IACUC utilizando la sobredosis de CO2 como método primario de eutanasia y la punción bilateral del neumotórax como método secundario de eutanasia de acuerdo con las Directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria22.</li>
	<li>Coloque a la rata en una almohadilla estéril en una mesa de disección con el lado ventral hacia abajo. Rocía el pelaje con etanol al 70%.</li>
</ol>7. Cosecha de ganglios de raíz dorsal (DRG)
<ol><li>Prepare medios de recorte que contengan 86 % de medios Neurobasal A, 10 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de penicilina-estreptomicina (PS), 1 % de glutamina y 2 % de B27 más 50x y transfiéralos a una placa de 24 pocillos. Este medio y la placa de pocillo se utilizarán para el almacenamiento temporal de los GRD cosechados antes de incrustarlos en el hidrogel.</li>
	<li>Use una bata de laboratorio, mascarilla quirúrgica, gorro, gafas de seguridad y guantes.</li>
	<li>Con unas tijeras grandes de punta roma, corte la piel en la base de la columna cervical y luego a lo largo de la columna.</li>
	<li>Para drenar aún más la sangre del canal espinal, corte por debajo de los omóplatos y hacia abajo a través del músculo para cortar los vasos sanguíneos principales.</li>
	<li>Use tijeras grandes y de punta afilada para cortar el músculo de la columna vertebral. Despeja la mayor cantidad de músculo posible para visualizar la columna vertebral.</li>
	<li>Extirpar los segmentos dorsal y lateral de las vértebras. Use un Rongeur recto y unas tijeras de punta afilada para eliminar las apófisis espinosas y transversales de las vértebras, comenzando en el extremo cervical y avanzando hacia el extremo lumbar.</li>
	<li>Extirpar la médula espinal. Use tijeras pequeñas de punta afilada para cortar cuidadosamente las raíces nerviosas conectadas a los DRG a lo largo de ambos lados de la médula espinal. Corte el extremo cervical de la médula espinal y levántelo con cuidado fuera del canal espinal gradualmente, cortando a través de las raíces nerviosas restantes conectadas a los DRG. NOTA: Las habilidades motoras finas son esenciales para garantizar que el cuerpo de DRG no se corte en el proceso.</li>
	<li>Para exponer los DRG, use el Rongeur curvo para eliminar más partes laterales de las vértebras. Tira hacia afuera desde la línea media, alternando los lados. Tenga cuidado de no cortar el cuerpo DRG, ya que puede causar daño a los cuerpos celulares y a los axones.</li>
	<li>Usando las pinzas # 3 y las tijeras de resorte de borde recto, retire los DRG entre cada nivel de las vértebras. Agarre las raíces del nervio espinal del DRG, sáquelas con cuidado del bolsillo y corte el otro extremo del nervio espinal. Tenga cuidado de no agarrar el cuerpo del DRG directamente.</li>
	<li>Coloque los GRD en pocillos de una placa de 24 pocillos (que contiene medios de recorte, paso 7.1) sobre hielo.</li>
	<li>Después de recolectar todos los DRG, limpie el espacio de trabajo, coloque el cadáver en una bolsa de autoclave y guárdelo/deséchelo adecuadamente de acuerdo con el protocolo de IACUC.</li>
</ol>8. Recorte y corte DRG
<ol><li>Llene una placa de Petri de 60 mm en un banco limpio con medios de corte (paso 7.1). Configure el endoscopio de disección y el esterilizador de perlas de vidrio y coloque una caja de herramientas esterilizada en autoclave con herramientas de recorte (pinzas # 3 y tijeras de resorte de borde recto) junto al endoscopio.</li>
	<li>Bajo el endoscopio de disección, retire el exceso de tejido alrededor del DRG y recorte las raíces nerviosas cerca del cuerpo del DRG (por lo general, un poco más oscuras que los nervios circundantes).</li>
	<li>Llene una segunda placa de Petri de 60 mm con medios nuevos. Bajo el endoscopio de disección, corte los DRG recortados a aproximadamente 0,5 mm (o entre 0,5 mm y 0,8 mm). Se coloca una regla debajo de la placa de Petri durante el corte para tener el tamaño estimado correcto de los DRG cortados.</li>
	<li>Transfiera los DRG cortados a una placa nueva de 24 pocillos con el medio en hielo. NOTA: El recorte, el corte y la inclusión de DRG deben realizarse en una cabina de flujo laminar para proporcionar un espacio de trabajo aséptico. En ausencia de una cabina de flujo laminar, se deben observar técnicas asépticas, con el equipo de protección personal (EPP) mínimo adecuado recomendado (bata de laboratorio, mascarillas, gafas y guantes) y todas las herramientas esterilizadas durante todo el proceso para mitigar la posible contaminación.</li>
</ol>9. Neutralización de colágeno
<ol><li>Neutralizar el colágeno el mismo día de la cosecha de DRG después de recortar y cortar los DRG.</li>
	<li>Trabajando con hielo, pipetee ~8,16 % de agua ultrapura, ~1,84 % de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M, ~10 % 10x PBS y ~ 80 % de colágeno del volumen total de solución en un vial de vidrio.</li>
	<li>Mezcle lentamente con una punta de pipeta estéril de baja retención para pipetear el colágeno (generalmente agregado al final) en la mezcla. Asegúrese de mantener la punta de la pipeta en la solución mientras mezcla para evitar la formación de burbujas. Verifique el pH del colágeno neutralizado usando tiras de pH para asegurarse de que sea ~7. NOTA: El colágeno neutralizado se puede mantener en hielo durante 2-3 h sin gelificarse; Por lo tanto, la fabricación de hidrogel debe llevarse a cabo de manera expedita una vez que se neutraliza el colágeno.</li>
</ol>10. Fabricación de hidrogel
<ol><li>Trabajando con hielo, pipetee laminina (hasta una concentración final de 0,75 mg/mL) y 1x PBS en un vial de vidrio.</li>
	<li>Utilizando puntas de pipeta estériles de baja retención, pipeteó el colágeno neutralizado y la solución de MAHA en la mezcla para llegar a la concentración deseada.</li>
	<li>Mezclar lentamente y comprobar el pH del hidrogel resultante (debe ser de ~7).</li>
</ol>11. Incrustación de DRG
<ol><li>Realizar la incrustación de varios compartimentos.<ol><li>Pipetear 65,1 μL y 52,8 μL del hidrogel premezclado en los compartimentos del soma y de la neurita, respectivamente. NOTA: Esto supone el uso de dispositivos MC en una placa de 48 pocillos. Estos volúmenes se pueden cambiar en función del tamaño del dispositivo MC utilizado.</li>
		<li>Incruste suavemente los DRG cortados en el compartimento del soma (Figura 2A), asegurándose de que no rayen el fondo de la placa del pocillo. Coloque el DRG en el centro para que las neuritas puedan crecer hacia los compartimentos adyacentes a través de los túneles.</li>
		<li>Reticulación térmica del hidrogel en la incubadora a 37 °C durante 30 min. Mientras esto ocurre, encienda la lámpara UV para calentarse.</li>
		<li>Después de la reticulación térmica, reticulación UV el hidrogel durante 90 s.</li>
		<li>Agregue el medio de crecimiento DRG al hidrogel y al DRG y realice un cambio completo del medio después de una hora para eliminar los rastros no reaccionados o restantes del fotoiniciador que persisten en el medio.</li>
		<li>Realice un cambio de medio medio cada 3 días y controle el crecimiento de los DRG observándolos bajo el microscopio.</li>
		<li>Después de ~ 4 semanas, cuando las neuritas DRG comiencen a crecer (Figura 3A), capture imágenes con el generador de imágenes de placa fluorescente y cuantifique la longitud de las neuritas usando FIJI (ImageJ).</li>
	</ol></li>
</ol>12. Controlar la incrustación de DRG
<ol><li>Pipetear 250 μL de hidrogel en una placa de 48 pocillos (sin MC).</li>
	<li>Coloque suavemente el DRG cortado en el centro del pocillo y hasta la mitad del hidrogel, asegurándose de que no raye el fondo de la placa del pocillo.</li>
	<li>Reticulación térmica del hidrogel en la incubadora a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Reticulación UV del hidrogel durante 90 s.</li>
	<li>Agregue el medio de crecimiento DRG al hidrogel y al DRG y realice un cambio completo del medio después de una hora.</li>
	<li>Realice el cambio de medio medio cada 3 días y controle el crecimiento del DRG observándolo bajo el microscopio.</li>
	<li>Después de ~ 4 semanas, cuando las neuritas DRG comiencen a crecer (Figura 3B), capture imágenes con el generador de imágenes de placa fluorescente. NOTA: Cualquier microscopio de campo claro funcionará para la obtención de imágenes. Un microscopio automatizado basado en placas hace que este proceso sea más rápido. La inclusión de control en geles simples sin el dispositivo se realiza para comparar el crecimiento de neuritas DRG en múltiples compartimentos. Una vez que los usuarios validan que los DRG crecen de manera similar en MC y geles de control, es posible que no necesiten repetir los geles de control cada vez.</li>
</ol>13. Imágenes DRG
<ol><li>Capture imágenes de campo claro con un aumento de 4x utilizando un generador de imágenes de placa fluorescente en un rango de distancias focales para visualizar todo el dispositivo DRG y MC.</li>
	<li>Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para facilitar la visualización de las neuritas.</li>
	<li>Guarde la imagen como un archivo .tiff.</li>
</ol>14. Cuantificación de neuritas DRG
<ol><li>Descargue e instale FIJI (ImageJ).</li>
	<li>Abra ImageJ. Abra el archivo de imagen y asegúrese de que el archivo sea monocromático.</li>
	<li>Mejore el contraste para que las neuritas más pequeñas sean visibles. Para ello, abre la opción de brillo y contraste con el atajo Ctrl+Shift+C.</li>
	<li>Ajuste los controles deslizantes del controlador según sea necesario para visualizar las neuritas y haga clic en Aplicar para obtener el brillo y el contraste deseados.</li>
	<li>Abra el trazador de neuritas abriendo el menú Plugins , seleccionando Segmentación y haciendo clic en Tracer de neurita simple.</li>
	<li>Inicie un nuevo trazo haciendo clic en un extremo de la neurita justo contra el cuerpo DRG.</li>
	<li>Haga clic en otro punto a lo largo de la neurita para agregar un trazo hasta que la neurita se trace de extremo a extremo. Haga clic en Finalizar ruta después de trazar la neurita.</li>
	<li>Convierta la longitud trazada a unidades reales y guarde los resultados copiándolos y pegándolos en Excel.</li>
	<li>Utilice la herramienta de línea recta en FIJI para dibujar una línea de la misma longitud que la barra de escala (sin soltar el final de la línea) y observe el valor de longitud visible debajo de la barra de herramientas. El valor de longitud se utiliza para la conversión.</li>
	<li>Mida la longitud de seis neuritas largas que se extienden desde ambos lados del DRG (Figura 3C, D) y calcule la longitud promedio de estas neuritas para obtener una longitud promedio representativa del DRG, como se muestra en la Figura 4. NOTA: La inmunotinción se ha probado en explantes de DRG en geles simples para mostrar la presencia de células de soporte no neuronales7. Los GRD se fijan en paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente, se lavan tres veces con 1x PBS durante 15 min y se almacenan en 1x PBS a 4 °C hasta la inmunotinción.</li>
	<li>En el caso de explantes en dispositivos MC, retire el dispositivo MC y siga el mismo proceso descrito anteriormente7.</li>
</ol>

Modelo in vitro avanzado para el estudio de la hipersensibilidad neuronal en cultivos de DRG

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+310+diseases+and+injuries,+1990-2015:+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2015.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015.</a> Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).</li><li>Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+as+a+global+public+health+priority.">Pain as a global public health priority.</a> BMC Public Health. 11 (1), 770 (2011).</li><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>Im, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+sensory+neurons+and+spinal+response+to+an+experimental+osteoarthritis+pain+model.">Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model.</a> Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).</li><li>Jensen, T. S., Finnerup, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allodynia+and+hyperalgesia+in+neuropathic+pain:+Clinical+manifestations+and+mechanisms.">Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms.</a> Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).</li><li>Berge, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+validity+of+behavioral+animal+models+for+chronic+pain.">Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain.</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).</li><li>Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+capillary+alginate+gel+(capgel&#8482;)+to+study+the+three-dimensional+development+of+sensory+nerves+reveals+the+formation+of+a+rudimentary+perineurium.">Use of a capillary alginate gel (capgel&#8482;) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium.</a> J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).</li><li>Mohammed Izham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+possibilities+of+using+in+vitro+model+for+neuropathic+pain+studies.">Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies.</a> Neurosci Res Notes. 5, 144 (2022).</li><li>Park, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+model+of+the+peripheral+nervous+system.">A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system.</a> NPG Asia Mater. 13 (1), 2 (2021).</li><li>Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+multi-compartment+in+vitro+model+for+dorsal+root+ganglia+phenotypic+assessment.">Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).</li><li>Krug, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+human+neurite+growth+assay+as+specific+screen+for+developmental+neurotoxicants.">Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants.</a> Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).</li><li>F, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+stiffness+negatively+affects+axon+elongation,+growth+cone+area+and+F-actin+levels+in+a+collagen+type+I+3D+culture.">Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture.</a> J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).</li><li>Spearman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+methacrylated+hyaluronic+acid-based+hydrogels+as+scaffolds+for+soft+tissue+engineering+applications.">Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).</li><li>Zhu, W., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+of+neonatal+and+adult+DRG+neurons+correlates+with+the+differential+sensitization+of+TRPV1+responses+to+nerve+growth+factor.">Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor.</a> Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).</li><li>Van De Wijdeven, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structuring+a+multi-nodal+neural+network+in+vitro+within+a+novel+design+microfluidic+chip.">Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip.</a> Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+transport+and+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+along+sensory+axons+promote+Schwann+cell+myelination.">Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination.</a> J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+drg+neurons.">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li><li>Seidlits, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+hyaluronic+acid+hydrogels+with+tunable+mechanical+properties+on+neural+progenitor+cell+differentiation.">The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation.</a> Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).</li><li>Tomal, W., Ortyl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+photoinitiators+in+biomedical+applications.">Water-soluble photoinitiators in biomedical applications.</a> Polymers. 12 (5), 1073 (2020).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avma+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals:+2013+edition.">Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition.</a> Veterinary Medical Association. , (2013).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Naveed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+of+dissection+protocols+for+the+rapid+isolation+of+rat+dorsal+root+ganglia+under+the+non-microscopic+condition.">Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition.</a> Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212 (2023).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+anatomical+rat+atlas.">A high-resolution anatomical rat atlas.</a> J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).</li><li>Bian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hyaluronic+acid+hydrogel+crosslinking+density+and+macromolecular+diffusivity+on+human+MSC+chondrogenesis+and+hypertrophy.">The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy.</a> Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dorsal+root+ganglia.">Human dorsal root ganglia.</a> Front Cell Neurosci. 13, 271 (2019).</li><li>Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+rat+and+human+dorsal+root+ganglion+proteome.">Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome.</a> Scientific Rep. 8 (1), 13469 (2018).</li></ol>

Los autores de este estudio declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Este protocolo describe un método para cosechar DRG adultos de Sprague Dawley y cultivarlos en hidrogeles naturales 3D. A diferencia de este método, otros enfoques para recolectar GRD de ratones y ratas implican el aislamiento de la columna vertebral. La columna vertebral extirpada se divide a la mitad y se extirpa la médula espinal para exponer los GRD 23,24,25. El daño a la médula espinal limita el suministro de sangre, l...

El dolor crónico es la principal causa de discapacidad y pérdida de trabajo en todo el mundo1. El dolor crónico afecta a alrededor del 20% de los adultos en todo el mundo e impone una carga social y económicasignificativa 2, con costos totales estimados entre $560 y $635 mil millones cada año en los Estados Unidos3.
La principal característica periférica que presentan los pacientes con dolor crónico es la disminución del umbral de estimulación de los nervios, lo que hace que el sistema nervioso responda mejor a los estímulos 4,5. La disminución del umbral de estimulación puede dar lugar a una respuesta dolorosa a un estímulo previamente no doloroso (alodinia) o a una respuesta intensificada a un estímulo doloroso (hiperalgesia)6. Los tratamientos actuales para el dolor crónico tienen una eficacia limitada, y los tratamientos que tienen éxito en modelos animales a menudo fracasan en los ensayos en humanos debido a las diferencias mecanicistasen la manifestación del dolor. Los modelos in vitro que pueden imitar con mayor precisión los mecanismos de sensibilización periférica tienen el potencial de aumentar la traducción de nuevas terapias 8,9. Además, al modelar aspectos clave de los nervios sensibilizados en un sistema de cultivo, los investigadores podrían desarrollar una comprensión más profunda de los mecanismos que impulsan los umbrales más bajos e identificar nuevos objetivos terapéuticosque los reviertan.
Las plataformas in vitro o sistemas microfisiológicos ideales incorporarían la separación física de las neuritas distales y el cuerpo de las células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), un entorno celular tridimensional (3D) y la presencia de células de soporte nativas para imitar de cerca las condiciones in vivo . Sin embargo, un trabajo reciente de Caparaso et al.11 muestra que las plataformas actuales de cultivo de DRG carecen de una o más de estas características clave, lo que las hace insuficientes para replicarse en condiciones in vivo . Aunque estas plataformas son fáciles de instalar, no imitan la base biológica de la sensibilización periférica y, por lo tanto, es posible que no se traduzcan en eficacia in vivo . Para abordar esta limitación, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológicamente relevante para el cultivo de ganglios de la raíz dorsal (DRG) dentro de una matriz de hidrogel con tres compartimentos aislados para permitir el aislamiento fluídico temporal de neuritas y cuerpos celulares DRG11. Este modelo ofrece relevancia tanto fisiológica como anatómica, que tiene el potencial de estudiar la sensibilización periférica de las neuronas in vitro.
El creciente interés en el uso de explantes de DRG en un cultivo 3D se debe a su capacidad para facilitar el crecimiento robusto de neuritas, lo que sirve como un indicador indirecto de la viabilidad de DRG12. Si bien los explantes primarios de DRG neonatales o embrionarios se utilizan predominantemente en las plataformas actuales de cultivo in vitro 13,14, el uso de explantes de roedores adultos proporciona un mejor modelo de la fisiología neuronal madura, que imita de cerca la fisiología humana de DRG en comparación con los explantes de roedores neonatos o embrionarios15. Los explantes de DRG se refieren a la preservación del tejido celular y molecular del tejido nativo de DRG, principalmente mediante el mantenimiento de células de soporte nativas no neuronales. En este documento, se describe la metodología para cosechar y cultivar explantes de DRG de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC) (Figura 1).
Se ha demostrado eficacia en el cultivo de GRD de la columna cervical, torácica y lumbar sin diferencias observables en el crecimiento de neuritas. Para esta aplicación, el objetivo era provocar el crecimiento de neuritas en los compartimentos exteriores del dispositivo; por lo tanto, este artículo no discriminó entre los niveles de GRD. Sin embargo, si es necesario para un experimento específico, el nivel de DRG se puede adaptar para satisfacer las necesidades de los experimentadores. Actualmente existen otros modelos de cultivo compartimentados para el cultivo 3D de DRGs16, sin embargo, estos dispositivos no contienen células de soporte no neuronales nativas preservadas, lo que puede limitar la traducción. La preservación de la estructura nativa de las DRG recolectadas es importante porque asegura la retención de las células de soporte no neuronales, cuyas interacciones con las neuronas DRG son esenciales para mantener las propiedades funcionales de estas neuronas. Varios estudios co-cultivaron DRGs disociadas con células neuronales no nativas, como las células de Schwann, para promover la mielinización de las neuronas 17,18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>For trimming and cutting DRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (autoclaved)</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td></td>
			<td>7.3 - 7.5 pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-892</td>
			<td>To temporarily store harvested and cut DRGs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe sterile, single use</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>To hold media for trimming and cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Plus 50x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved cup Friedman Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11293-00</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form cure</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td></td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form wash</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td></td>
			<td>To wash excess resins off MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9531961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (8 mL)</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>224724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temp V2 resin</td>
			<td>FormLabs</td>
			<td>FLHTAM02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>53747</td>
			<td>Used to make MAHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>344600501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt-nose scissors</td>
			<td>Militex</td>
			<td>EG5-26</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps (serrated tips)</td>
			<td>Militex</td>
			<td>9538797</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large sharp-nosed scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14010-15</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Retention pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-017</td>
			<td>For pipetting collagen and MAHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>85 - 115 % methacrylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG-100</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516106</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH35309.606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preform 3.23.1 software</td>
			<td>Formslab</td>
			<td></td>
			<td>To upload STL file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin 3D printer</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td>Form 3L</td>
			<td>3D printing MC device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small sharp-nosed scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight cup rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight edge spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scaplel blade (No. 10)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filters, PES (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiny spring scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td>For trimming and cutting DRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td></td>
			<td>To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting, embedding, and culturing dorsal root ganglia in multi-compartment devices to study peripheral neuronal features

La característica neuronal periférica más común del dolor es un umbral de estimulación disminuido o hipersensibilidad de los nervios terminales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Una de las causas propuestas de esta hipersensibilidad está asociada a la interacción entre las células inmunitarias del tejido periférico y las neuronas. Los modelos in vitro han proporcionado conocimientos fundamentales para comprender cómo estos mecanismos dan lugar a la hipersensibilidad de los nociceptores. Sin embargo, los modelos in vitro se enfrentan al reto de trasladar la eficacia a los humanos. Para abordar este desafío, se ha desarrollado un modelo in vitro fisiológica y anatómicamente relevante para el cultivo de ganglios de raíz dorsal intactos (DRG) en tres compartimentos aislados en una placa de 48 pocillos. Los DRG primarios se extraen de ratas Sprague Dawley adultas después de la eutanasia humanitaria. Se recorta el exceso de raíces nerviosas y el DRG se corta en tamaños apropiados para el cultivo. A continuación, los GRD se cultivan en hidrogeles naturales, lo que permite un crecimiento robusto en todos los compartimentos. Este sistema multicompartimentado ofrece un aislamiento anatómicamente relevante de los cuerpos celulares DRG de las neuritas, los tipos de células fisiológicamente relevantes y las propiedades mecánicas para estudiar las interacciones entre las células neuronales e inmunitarias. Por lo tanto, esta plataforma de cultivo proporciona una herramienta valiosa para investigar las estrategias de aislamiento del tratamiento, lo que en última instancia conduce a un mejor enfoque de detección para predecir el dolor.

Chronic pain is the leading cause of disability and loss of work globally1. Chronic pain affects about 20% of adults globally and imposes a significant societal and economic burden2, with total costs estimated between $560 and $635 billion every year in the United States3.
The main peripheral feature exhibited by chronic pain patients is a lowered stimulation threshold of nerves, which leads to the nervous system being more responsive to stimuli4,5. The lowered stimulation threshold can result in a painful response to a previously non-painful stimulus (allodynia) or a heightened response to a painful stimulus (hyperalgesia)6. Current chronic pain treatments have limited efficacy, and treatments that succeed in animal models often fail in human trials due to mechanistic differences in pain manifestation7. In vitro models that can more accurately mimic peripheral sensitization mechanisms have the potential to increase the translation of new therapeutics8,9. Further, by modeling key aspects of sensitized nerves in a culture system, researchers could develop a deeper understanding of the mechanisms that drive lowered thresholds and identify novel therapeutic targets that reverse them10.
The ideal in vitro platforms or microphysiological systems would incorporate the physical separation of distal neurites and dorsal root ganglia (DRG) cell body, a three-dimensional (3D) cellular environment, and the presence of native support cells to closely mimic in vivo conditions. However, a recent paper by Caparaso et al.11 shows that current DRG culture platforms lack one or more of these key features, making them insufficient in replicating in vivo conditions. Even though these platforms are easy to set up, they do not mimic the biological basis of peripheral sensitization and thus may not translate to in vivo efficacy. To address this limitation, a physiologically relevant in vitro model has been developed for the culture of dorsal root ganglia (DRG) within a hydrogel matrix with three isolated compartments to allow temporal fluidic isolation of neurites and DRG cell bodies11. This model offers both physiological and anatomical relevance, which has the potential to study peripheral sensitization of neurons in vitro.
The growing interest in the use of DRG explants in a 3D culture is due to their ability to facilitate robust neurite growth, which serves as an indirect indicator of DRG viability12. While primary neonatal or embryonic DRG explants are predominantly used in current in vitro culture platforms13,14, using explants from adult rodents provides a better model of mature neuronal physiology, which closely mimics human DRG physiology compared to explants from neonatal or embryonic rodents15. Explant DRGs refer to the preservation of the cellular and molecular tissue of native DRG tissue, primarily by maintaining native non-neuronal support cells.Herein, this protocol describes the methodology to harvest and culture DRG explants from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device (Figure 1).
Efficacy has been shown in culturing DRGs from the cervical, thoracic, and lumbar spine with no observable differences in neurite growth. For this application, the objective was to elicit neurite growth into the outer compartments of the device; therefore, this article did not discriminate among DRG levels. However, if needed for a specific experiment, the DRG level can be tailored to meet experimenters&#39; needs. There are currently other compartmentalized culture models for the 3D culture of DRGs16, however, these devices do not contain preserved native non-neuronal support cells, which can limit translation. Preserving the native structure of harvested DRGs is important because it ensures the retention of non-neuronal support cells, whose interactions with DRG neurons are essential for maintaining the functional properties of these neurons. Several studies co-cultured dissociated DRGs with non-native neuronal cells such as Schwann cells to promote myelination of neurons17,18,19.

Autor destacado: Modelos in vitro e in vivo para mejorar la eficacia del tratamiento del dolor crónico

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

El presente protocolo describe una técnica para cosechar y cultivar DRG de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC). Como se muestra en la Figura 1, el DRG cosechado de ratas adultas se recortó y se cortó en ~0,5 mm. A continuación, los DRG recortados y cortados se incrustaron en un hidrogel en la región del soma del dispositivo MC (Figura 2) y se cultivaron durante 27 días antes de la cuantificación de la ne...

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

harvesting-embedding-culturing-dorsal-root-ganglia-multi-compartment

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

552 vistas.  University of Nebraska-Lincoln. Nuestra investigación busca comprender algunos de los mecanismos subyacentes que contribuyen al dolor musculoesquelético crónico, para que podamos desarrollar nuevos tratamientos específicos. Así, hemos desarrollado modelos in vitro e in vivo de lumbalgia crónica y sensibilización neuronal. Las terapias actuales que funcionan in vivo en modelos animales a menudo fracasan en los ensayos clínicos debido a las diferencias mecanicistas entre los modelos a...

Video: Autor destacado: Modelos in vitro e in vivo para mejorar la eficacia del tratamiento del dolor crónico

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia (DRG). One proposed cause of this hypersensitivity is associated with the interaction between immune cells in the peripheral tissue and neurons. In vitro models have provided foundational knowledge in understanding how these mechanisms result in nociceptor hypersensitivity. However, in vitro models face the challenge of translating efficacy to humans. To address this challenge, a physiologically and anatomically relevant in vitro model has been developed for the culture of intact dorsal root ganglia (DRGs) in three isolated compartments in a 48-well plate. Primary DRGs are harvested from adult Sprague Dawley rats after humane euthanasia. Excess nerve roots are trimmed, and the DRG is cut into appropriate sizes for culture. DRGs are then grown in natural hydrogels, enabling robust growth in all compartments. This multi-compartment system offers anatomically relevant isolation of the DRG cell bodies from neurites, physiologically relevant cell types, and mechanical properties to study the interactions between neural and immune cells. Thus, this culture platform provides a valuable tool for investigating treatment isolation strategies, ultimately leading to an improved screening approach for predicting pain.

This protocol provides a technique to harvest and culture explanted dorsal root ganglion (DRG) from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device.