Enfoques de biología estructural y química analítica para la caracterización de las enzimas metabólicas C-glucósidos en la microbiota intestinal humana. Protocolo. Uno, la producción y purificación de proteínas. Construcción de vector de expresión.
Obtenga la secuencia del grupo de genes GenBank LC422372.1 del NCBI. Clonar los genes en un vector pET-28a modificado. Transformar los plásmidos en células competentes para E.coli BL21 DE3.
Posteriormente, cultive las bacterias en medio LB con 50 microgramos por mililitro de kanamicina a 37 grados. Añadir 0,2 milimoles de IPTG al medio cuando la densidad bacteriana OD600 alcance 0,6. Cultive las bacterias a 16 grados durante 16 horas.
Centrifugar el cultivo bacteriano a 4.000 veces g a cuatro grados. Deseche el sobrenadante y conserve la pastilla bacteriana. Resuspender el pellet bacteriano en el tampón A.Purificación de proteínas.
Agregue un milimol de PMSF a la resuspensión bacteriana. Lisar la suspensión de bacterias mediante un rompedor celular ultrasónico. Centrifugar el lisado bacteriano a 48.000 veces g durante 40 minutos a cuatro grados.
Purifique la proteína en el sobrenadante utilizando la columna NTA de cromatografía de afinidad de níquel. Eluir la proteína unida con tampón B en un gradiente. Recoja muestras con alta absorción UV de 280 nanómetros y bandas de proteínas transparentes de SDS-PAGE para el siguiente paso.
Diálisis las muestras con el tampón C. Purifique la proteína dializada mediante una columna de cromatografía de intercambio iónico. Unir la proteína objetivo a la columna con el tampón C.Eluir la proteína unida con el ingrediente tampón D. Purifique la proteína utilizando una columna de exclusión de tamaño con tampón E.Recoja muestras de proteína para el siguiente paso.
Concentre las muestras de proteína a 20 miligramos por mililitro, alícula rápidamente, congélela con nitrógeno líquido. Guárdelo a 80 grados para usarlo en el futuro. Mida la concentración de proteínas usando QuickDrop con UV 280 nanómetros.
Dicroísmo circular, CD, recogida de datos espectrales. Diluir las proteínas a 0,2 miligramos por mililitro en un tampón de PBS multiplicado, pH 7,4. Establezca la velocidad de escaneo del instrumento en 50 nanómetros por minuto y el ancho de banda espectral en un nanómetro.
Recopile datos espectrales de CD en el rango de longitud de onda de 200 a 260 nanómetros. Reste el fondo PBS y tome el valor promedio de tres mediciones. Dos, cristalografía de proteínas y determinación estructurada.
Crecimiento y optimización de cristales proteicos. Realice el cribado inicial de cristalización con el método de gota sentada utilizando los kits de cristalización de proteínas en placas de cristal de 48 pocillos. Establezca los gradientes de precipitante y concentración de proteínas para optimizar la cristalización de proteínas utilizando el método de gota colgante.
Transfiera los cristales a una solución de remojo que contenga tampón de depósito y compuestos objetivo a 16 grados durante 30 minutos después del crecimiento completo. Transfiera los cristales a una solución crioprotectora que contenga tampón de cristalización suplementado con un 25% de glicerol y se almacene inmediatamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos. Recogida de datos y determinación estructurada de cristales proteicos.
Recopile el conjunto completo de datos de difracción de rayos X en las líneas de luz de la SSRF de la NFPS utilizando longitudes de onda incidentes de 0,978 angstroms. Procese los datos de difracción de cristales inicialmente utilizando el software de procesamiento de datos cristalográficos del programa. Realice el escalonamiento mediante un programa de procesamiento automático de datos.
Utilice el software de determinación de la estructura cristalina para el refinamiento y la optimización automáticos del modelo de estructura. Tres, monitorización de la actividad de reacción y determinación de los parámetros cinéticos. Monitorización de la actividad de DgpA/B/C por HPLC.
Ensamble el sistema de reacción de escisión de glucósidos C en tampón PBS, pH 7.4, que contiene 20 micromoles por mililitro DgpA/B/C, un milimoles por litro de ion manganeso, un milimoles por litro de NAD, 10 milimoles por litro de DTT y 0.1 milimoles por litro de sustrato, puerarina, daidzina, genistina. Mezclar bien pipeteando e incubar a 37 grados durante ocho horas. Agregue tres veces la cantidad de metanol al sistema de reacción para terminar la reacción.
Centrifugar la solución de reacción a 16.000 veces g durante 15 minutos para eliminar el precipitado. Filtre el sobrenadante con una membrana filtrante de 0,22 micrómetros. Realice análisis de HPLC con elución en gradiente a un caudal de un mililitro por minuto, longitudes de onda de detección de UV 265 nanómetros y un volumen de inyección de 10 microlitros.
Monitorización de la actividad de DgpA con el ensayo 2,6-diclorofenol indofenol, DCPIP. Incube 0,8 milimoles por litro de DCPIP, 50 micromoles por litro de proteína y 10 milimoles por litro de sustrato en un tampón de PBS de una vez, pH 7,4. Después de 20 horas de reacción, registre el cambio de absorbancia de DCPIP a 600 nanómetros utilizando un lector de microplacas.
Determinación de la tasa de inhibición de la glucosa en la reacción de escisión del enlace C-glicosídico de la puerarina. Llevar a cabo la reacción en un tampón PBS de una vez, pH 7,4, a diferentes concentraciones de glucosa al sistema de reacción como se describe en la sección 3.1. Realice la reacción a 37 grados durante 12 horas.
Realizar análisis cuantitativos de los productos generados mediante HPLC. Determinación de parámetros cinéticos. La concentración de puerarina se establece de 0,01 a cuatro milimoles por litro, y la de daidzina y genistina fue de 0,01 a dos milimoles por litro en la reacción de escisión de C-glucósidos DgpA/B/C.
Llevar a cabo la reacción a 37 grados durante ocho horas según el método descrito en la sección 3.1. Derive los parámetros cinéticos de Km y kcat ajustando la velocidad de reacción calculada y la concentración de sustrato a un modelo Michaelise-Menten en Prism. Cuatro, preparación y detección del producto intermedio de la reacción.
Preparación del producto intermedio de reacción. Utilice daidzina y genistina como sustratos para llevar a cabo la reacción de acuerdo con los métodos descritos en la sección 3.1 con un sistema de reacción de 90 mililitros. Purifique el producto intermedio mediante una HPLC preparatoria con una columna de cromatografía líquida preparativa.
Seque los productos intermedios purificados con un concentrador centrífugo al vacío para su uso futuro. Caracterización del producto intermedio de reacción con LC-MS. Disuelva una parte de los productos intermedios purificados de las reacciones de daidzina y genistina en metanol para preparar soluciones de cada compuesto a 50 microgramos por mililitro.
Centrifugar a 13.500 veces g durante 10 minutos y recoger los uspernadantes para el análisis LC-MS/MS. Utilice el mismo programa de elución en gradiente que en el análisis de HPLC para el análisis de LC-MS con un volumen de inyección de cinco microlitros. Caracterización del producto intermedio de reacción con RMN.
Disuelva una parte de los productos intermedios purificados de la reacción de daidzin en dimetilsulfóxido-deuterado seis para espectroscopía de RMN de protones y carbono 13. Registre los espectros de RMN en un instrumento de RMN a 400 megahercios para un protón. Registre los espectros de RMN en un instrumento de RMN a 175 megahercios para el carbono 13.
Resultados representativos. En general, diseñamos un enfoque experimental combinado que incluye la producción y purificación de proteínas, experimentos de cristalización, ensayos de actividad y la identificación de estructuras de productos de reacción en la figura uno. Específicamente, obtuvimos proteínas de alta pureza a través de una cromatografía de purificación de tres pasos, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel en la figura dos.
En los experimentos de cristalización, determinamos las estructuras cristalinas de DgpA y el complejo DgpB/C con resoluciones de 2.7 angstroms y 2.1 angstroms, respectivamente, en las figuras 3A a D. Además, descubrimos que la DgpA adopta una confirmación autoinhibida en su forma hexámera en las figuras 3B y C, que se validó utilizando el ensayo de reducción DCPIP en la figura 3F. A continuación, descubrimos que la glucosa forma una red de enlaces de hidrógeno con aminoácidos clave en el bolsillo de reconocimiento de sustrato de DgpA en la figura 3E. Con base en esto, diseñamos mutantes y evaluamos su actividad de escisión del sustrato utilizando los parámetros cinéticos de la figura 3J.
Curiosamente, durante la escisión de los flavonoides O-glicosídicos y DgpA/B/C, observamos la formación de compuestos intermedios en las figuras 4A y B. Estos intermedios se identificaron como flavonoides C-glicosídicos a través de análisis de RMN y LC-MS en las figuras 4C a H, lo que indica que DgpA/B/C puede convertir los O-glucósidos en C-glucósidos.Conclusión. Hemos sido pioneros en la integración de la química y la biotecnología para estudiar la estructura y las características funcionales de las enzimas del metabolismo de los glucósidos C, demostrando que se trata de una solución razonable y práctica. Este enfoque llena los vacíos en las metodologías de investigación dentro del campo y se puede aplicar fácilmente a otros genes con diferentes funciones metabólicas.
Por lo tanto, también proporciona un nuevo modelo de referencia para futuros estudios sobre las características estructurales y funcionales de otras proteínas funcionales microbianas intestinales.
