Nuestro protocolo funciona como una herramienta para encontrar compuestos que inhibe la desactividad de la pirofosfatasa ligada a la membrana. Y estos inhibidores se pueden utilizar en el tratamiento de varias enfermedades parasitarias. Este protocolo es barato y simple produciendo color estable durante mucho tiempo sin mostrar ninguna interferencia en presencia de alta concentración de fosfolípidos necesaria para la reactivación de enzimas.
Preparar 10 mililitros de la solución tampón de reactivación, que contiene 20 milimolar M-E-S a PH 6.5, 3.5% de volumen por volumen de glicerol, dos mililitrolares D-T-T y 0.05%D-D-M. Preparar 10 mililitros del mezclador de reacción, que contiene 200 tris de milimolar clorhidrato a ocho PH. Cloruro de magnesio de ocho milimolares, cloruro de potasio 333 milimolar y cloruro de sodio 67 milimolar.
Preparar 30 miligramos por mililitro liposomas para la reactivación de enzimas. En primer lugar, añadir 10 mililitros de 20 milimolar de clorhidrato de tris a PH ocho, con un D-T-T mililar a 0,3 gramos de alfa fosfatidilcolina L de soja. Ponga el liposoma en hielo y sonicar con un segundo post-intervalos durante un minuto.
Haga una pausa durante un minuto y repita hasta que la solución se vuelva amarilla transparente. Aliquot los liposomas en 100 microlitros, congelar el nitrógeno líquido y almacenar a 80 grados Celsius negativos hasta que se utilice. Para reactivar la enzima, descongele la solución liposoma a temperatura ambiente.
Mezclar 40 microlitros de la solución liposoma con 22,5 microlitros de 20%D-D-M. Mantener la mezcla a 55 grados centígrados durante 15 minutos. Y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
A continuación, agregue 36,5 microlitros de la solución de búfer de reactivación. Mezcle y agregue un microlitro de proteína concentrada para hacer una concentración total de 0,13 miligramos por mililitro. A continuación, transfiera 20 microlitros de la enzima reactivada a 1480 microlitros de la mezcla de reacción.
Mezclar suavemente y usar inmediatamente. En primer lugar, disolver los compuestos en D-M-S-O para hacer soluciones de stock de 50 milimolar en 200 microlitros. Para compuestos solubles, diluya la solución de stock con agua a un mililitro en microtubos, para dar dos, 10 y 100 micromolares.
Para cada dilución, vórtice la solución compuesta para una mezcla adecuada. Después de eso, compruebe si hay divergación de compuestos, y utilizando una pipeta multicanal, dispensar 75 microlitros de la mezcla de reacción en cada pozo en una placa de 96 pozos. Agregue 75 microlitros de cada compuesto y agua como control en triplicado, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.
Mida cada pocóter a 300 voltios utilizando un neflómetro de microplaca. Para preparar la solución de citrato de arsenita, pesa cinco gramos de arsenita sódica y cinco gramos de citrato de trisódico dihidrato, disuelve ambos compuestos en 100 mililitros de agua. A continuación, añadir cinco mililitros de ácido acético glacial.
Mezclar y añadir agua a 250 mililitros, almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz. A continuación, preparar la solución A añadiendo 10 mililitros de hielo frío 0,5 ácido clorhídrico molar a 0,3 gramos de ácido ascórbico Disolver el ácido ascórbico por vórtice. Prepare la solución B añadiendo un mililitro de agua helada a 70 miligramos de tetrahidrato de amonio tetrataomolybdate, y vórtice para disolver.
Almacene la solución A y B sobre hielo. Para preparar el estándar de fosfato con una concentración de cero, 62,5, 250 y 500 micromolares para calibración. Agregue cero microlitros, 12,5 microlitros, 50 microlitros y 100 microlitros de 5 fosfato disódico milimio dihidrato a cuatro microtubos que contienen 370 microlitros de la mezcla de reacción.
Re cubra hasta un mililitro con agua. Ahora agregue un mililitro de solución B a 10 mililitros de solución A, mezcle a mano y almacene la solución en hielo. Usando una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de cero, 62.5, 250 y 500 micromolares de fosfato estándar a los scripts de tubo en triplicado.
A continuación, añada 25 microlitros de solución compuesta y 15 microlitros de la mezcla de solución M-P-P-A de cada tubo. Excepto los tubos que contienen fosfato estándar. Selle las tiras de tubo con una lámina de sellado adhesiva.
Corte la hoja de sellado para separar cada tira de tubo. A continuación, preinscinda la muestra durante cinco minutos a 71 grados centígrados. Coloque la muestra en el bloque calefactor con intervalos de 20 segundos entre cada tira.
Para cada tira, abra el sellado adhesivo. Usando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de dos dibásicas de pirofosfato sódico molar. Y mezcle en pipeteando arriba y abajo durante cinco veces.
Selle la tira de tubo de nuevo con el mismo sellado. Incubar de nuevo a 71 grados centígrados durante cinco minutos. Después de eso, coloque las muestras en el aparato de enfriamiento con un intervalo de 20 segundos entre cada tira.
Dejar enfriar durante cinco minutos y luego centrifugar cada tira brevemente para decantar las gotas de agua debajo de la hoja de sellado. Vuelva a colocar la tira en el aparato de refrigeración, retire el sellado y déjelos enfriar durante otros cinco minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de la solución A y B, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante cinco veces, y mantenga las tiras de tubo en el aparato de enfriamiento durante 10 minutos más.
En una campana de humo, agregue 90 microlitros de la solución de citrato de arsenita y manténgalo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Para producir un color azul estable. Dispensar 180 microlitros de cada mezcla de reacción en una microplaca de poliestireno transparente de 96 pocillos.
Utilice un espectrofotómetro de microplacas para medir la absorbancia de cada pozo a 860 nanómetros. En este protocolo, ocho compuestos fueron probados junto con I-D-P, un inhibidor común de la pirofasfatasa como un control positivo. Después de la adición de la solución A y B, y citrato de arsenita, un color azul en 30 minutos de incubación a temperatura ambiente.
Las tres concentraciones de compuestos no inhibidores, mostraron la misma intensidad de color azul. Así como E-1 a E-3 sin ningún inhibidor. La gráfica de la actividad enzimática contra la concentración de cada compuesto probado, muestra que el compuesto con actividad de inhibición formó un ajuste de curva no lineal.
La gráfica de I-D-P como control positivo, muestra claramente una disminución en la actividad a concentraciones más altas. La curva de inhibición para los compuestos uno, cinco, seis, siete y ocho. Muestra concentraciones inhibitoras medias a 1,7 micromolares, 21,4 micromolares, 58,8 micromolares, 239,0 micromolares y superiores a 500 micromolares, respectivamente.
Recuerde prepararse, la solución M-P-P-A. Justo antes del comienzo del ensayo.
