Nuestro objetivo es desarrollar y caracterizar un modelo basado en organoides para imitar el tracto gastrointestinal y compararlo con cerdos vivos, y centrarnos en las características de transporte. El cambio de un experimento clásico con animales a. En nuestro campo de la fisiología gastrointestinal a un.
Modelo in vitro basado en organoides, que imita la situación in vivo. Combinamos nuestro modelo del intestino delgado y grueso de los organoides con. El cual se puede utilizar para investigar las características de transporte en tiempo real para permitir una comparación de nuestro modelo y la situación de los cerdos vivos.
Especialmente en el campo de la investigación relacionada con la ganadería, los modelos alternativos a los experimentos clásicos con animales son raros. Superamos esta limitación mediante el uso de nuestro modelo basado en organoides del tracto intestinal porcino. Planeamos utilizar nuestro modelo intestinal basado en organoides para estudiar los efectos de las bacterias patógenas porcinas.
Con ello se pretende conocer los mecanismos de patogenicidad de estas bacterias. Para comenzar, mezcle la membrana basal recién descongelada en una proporción de 1:40 con PBS estéril helado en un tubo cónico. Agregue 200 microlitros de esta mezcla al compartimento apical de cada inserto dentro de las placas estériles.
Vuelva a colocar la tapa de la placa del pocillo e incube durante al menos 1,5 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, aspire cuidadosamente la solución sin tocar la membrana. Retire el medio organoide de los pocillos que contienen organoides de cripta tridimensionales.
Para disolver la membrana basal, agregue un mililitro de PBS helado al pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo con una punta P1000. Recoja todos los organoides disueltos en un tubo de 15 mililitros precargado con 10 mililitros de PBS helado. Centrifugar el tubo a 250 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de EDTA tibio al 0,05% de tripsina. Incuba el tubo durante cinco minutos a 37 grados centígrados en un baño de agua y luego colócalo en hielo para detener la reacción. Con una punta P1000, pipetea hacia arriba y hacia abajo 20 veces para volver a suspender completamente los organoides, y luego, repita otras 15 veces usando una punta P1000 con una punta P200 adjunta en la parte superior.
Ahora, agregue 10 mililitros de DMEM helado suplementado con suero de ternera fetal al 10%, o FCS. Centrifugar el tubo a 1000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio monocapa.
Usando una cámara de Neubauer, siga las instrucciones del fabricante para determinar el número de células vivas por mililitro. Ahora, reemplace la solución de recubrimiento del compartimiento apical con 500 microlitros del medio monocapa, templado a 37 grados centígrados, y agregue tres mililitros del medio monocapa al compartimiento lateral basal. Retire el medio monocapa apical.
Para el cultivo 2D, agregue 500 microlitros de medio monocapa que contenga una cantidad adecuada de células a la cámara apical de cada pocillo e incube las células. Para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial o del desgarro, limpie el electrodo del palillo con etanol al 70% y deje que se seque completamente. Introduzca el brazo corto del electrodo de palillo en el compartimento apical y el brazo largo en el compartimento lateral basal de los insertos.
A continuación, encienda y deje que el. Equilibre el medidor para obtener una medición estable, luego haga clic en el botón almacenar para registrar los valores de TEAR. Después de medir el último pozo, haga clic en guardar para almacenar los datos en un dispositivo USB.
Limpie el electrodo después de cada placa y al final de la medición. Deje que el electrodo se seque por completo antes de guardarlo. Reste los valores de TEAR en blanco determinados antes de sembrar las celdas de los valores celulares medidos.
Cambie el medio y mida TEAR cada dos o tres días, asegurándose de que TEAR se mida antes de cambiar el medio. Agregue con cuidado 500 microlitros, o tres mililitros, de medio de diferenciación fresco y tibio a los compartimentos apical y basal. El día 18 para los organoides yeyunales, o el día nueve para los organoides colónicos, después de la siembra, proceda con los experimentos funcionales.
Calentar las soluciones tampón mucosas y serosas a 37 grados centígrados y airear con carbógeno. Ensamble las cámaras individuales usando un inserto vacío para cada cámara individual, asegurándose de que los lados apicales de los pocillos transversales estén todos orientados en la misma dirección. Llene todas las cámaras con cinco mililitros de solución tampón de mucosa precalentada.
Conecte todos los electrodos de la pinza de voltaje a las cámaras individuales siguiendo las instrucciones del fabricante. Para calibrar el software de la cámara de uso, haga clic en el botón RFDPI en el software de la pinza de voltaje. Confirme que la resistencia de todos los insertos vacíos es de aproximadamente 70 ohmios y que la corriente es de alrededor de cero milivoltios.
Retire todos los electrodos y deseche la solución tampón usada. Abra las cámaras individuales, retire los insertos vacíos y mantenga el orden de las cámaras. Ahora, debajo del gabinete de seguridad, aspire con cuidado el medio basolateral y apical de la placa.
Lavar las células con 500 microlitros de tampón mucoso caliente en la cámara apical, y con tres mililitros de tampón serosa en la cámara basolateral. Retire los insertos de la placa y retire suavemente sus soportes. Coloque los insertos en las cámaras de uso, asegurándose de que la orientación coincida con la fase de calibración.
Después de ensamblar las cámaras individuales, llene las cámaras que miran hacia el lado basolateral de las células con cinco mililitros de tampón seroso, y las que miran hacia el lado apical con cinco mililitros de tampón mucoso. Conecte los electrodos y los tubos de aireación a cada cámara individual e inicie la medición en el software Ussing. Cambie las condiciones del modo de circuito abierto al modo de cortocircuito en el software.
Después de cinco a 10 minutos de equilibrio, agregue 10 micromolares de forskolina a la cámara serosa. Después de 15 minutos, detenga la medición, retire los tubos de aireación y los electrodos de las cámaras y desmonte las cámaras. Los valores de resistencia eléctrica transepitelial aumentaron progresivamente durante el cultivo, alcanzando un máximo de 150 ohmios por centímetro cuadrado para el yeyuno después de 18 días, y 200 ohmios centímetro cuadrado para los organoides del colon después de nueve días.
Los valores basales de corriente de cortocircuito fueron significativamente menores en los organoides de yeyuno que en los organoides de colon, mientras que los valores de resistencia basal no mostraron diferencias significativas. Los tratamientos con forskolina aumentaron significativamente los valores basales de corriente de cortocircuito en organoides yeyunales de 0,86 a 27,78 microamperios por centímetro cuadrado, y en organoides colónicos de 3,83 a 28,78 microamperios por centímetro cuadrado.
