Este es el protocolo más rápido y correcto para monitorear la acidificación intestinal de Drosophila con resultados robustos y auténticos. Este método ayudará a determinar el papel de la acidificación intestinal en múltiples organismos. Y este fenómeno es La simplicidad de esta técnica es la principal ventaja.
Como tal, se puede utilizar para los organismos no modelo. Este método puede monitorear la liberación de ácido para muchos sistemas, incluidas las líneas celulares y 3D en cultivos vivos. Esta técnica es simple con el mínimo esfuerzo.
Los alimentos que contienen azul de bromofenol deben prepararse frescos. Además, mientras que la disección intestinal no debe estirarse. Comience a organizar el ensayo de monitoreo de acidificación intestinal con la preparación del alimento para moscas con azul de bromofenol sensible al pH o colorante BPB.
Para hacerlo, derrite la comida para moscas en un microondas y deja que se enfríe hasta que esté tibia. Agregue un mililitro de 4% BPB a un mililitro del alimento tibio con un pozo de mezcla. Usando una pipeta, agregue el alimento para moscas que contiene BPB en un solo punto de aproximadamente 200 microlitros en el centro de una placa de Petri.
A continuación, recoja moscas hembras no vírgenes de cero a dos días de edad Drosophila melanogaster, y permita que las moscas se recuperen con alimentos estándar de harina de maíz. Antes del experimento, muera de hambre a las moscas durante 24 horas a temperatura ambiente en un vial que contiene un pañuelo de laboratorio empapado con aproximadamente dos mililitros de agua desionizada. Transfiera las moscas hambrientas a una placa de Petri que contenga puntos individuales de la comida para moscas recién preparada, complementada con 2% BPB, para permitir que las moscas se alimenten durante cuatro horas a temperatura ambiente mientras están expuestas a la luz.
Después de cuatro horas recolectar las moscas, luego proceder a aislar quirúrgicamente los intestinos de las moscas anestesiadas en 1X PBS con fórceps bajo un microscopio estereoscópico. Cuente el número de moscas que muestran BPB robusto de pie en las tripas y calcule el porcentaje utilizando la ecuación. Después de la disección, monte las muestras en PBS en un portaobjetos de vidrio y coloque la diapositiva preparada bajo el microscopio.
Luego ajuste el enfoque usando el IPS. Una vez hecho esto, apague el IPS para abrir el obturador de la cámara. Después de la disección intestinal, se encontró que algunas moscas hembra de Drosophila melanogaster producen ácido como lo indica el color amarillo en el CCR del intestino.
Mientras que los intestinos de algunas moscas eran azules, lo que sugiere un fracaso de las moscas para acidificar sus intestinos. En 30 minutos, aproximadamente el 20% de las moscas habían acidificado el intestino. Después de una hora, el 40% de los intestinos intestinales mostraron acidificación, mientras que después de dos o tres horas de alimentación, el porcentaje de intestinos acidificados aumentó a 60 a 70%Casi del 90 al 95% de los intestinos se acidificaron cuando las moscas fueron alimentadas durante cuatro horas.
No se observaron diferencias en la acidificación intestinal para dos condiciones de temperatura diferentes. La eficiencia del protocolo de acidificación intestinal se evaluó en varias especies de Drosophila. Todas las especies probadas mostraron una acidificación intestinal robusta, lo que sugiere que el protocolo se puede aplicar a otros organismos.
Lo más importante a recordar, es colocar las moscas estrella en la placa de Petri con levadura y azul de bromofenol durante cuatro horas. Esta técnica ayudará a comprender la biología básica y la vía celular involucrada en la acidificación intestinal. También debería ayudar a identificar el objetivo del medicamento para crear las enfermedades relacionadas con la acidificación intestinal.
