Este protocolo se utiliza para estudiar las cualidades de transporte de las uniones estrechas. Usando potenciales de dilución, puede medir la permselectividad y obtener una comprensión de las uniones estrechas en un tejido. Esta técnica es específica y utiliza tejidos nativos para estudios funcionales de epitelios.
Además, esta técnica mide las propiedades fisiológicas en tiempo real de un tejido, lo cual es muy útil. El mayor desafío es la preparación de tejidos. Practicar la técnica, así como ver este video ayudará.
para confirmar la viabilidad de los tejidos también es un paso importante. Para comenzar, coloque los segmentos deseados de tejido intestinal recolectados de ratones knockout de claudina-15 en la solución de Ringer burbujeada helada y recorte la grasa y el tejido conectivo. Después de recortar la grasa y el tejido conectivo, corte a lo largo de los accesorios mesentéricos para abrir cada segmento longitudinalmente, luego devuelva los segmentos a la solución helada de Ringer y lave bien las piezas.
Para despojar la capa muscular, vierta de dos a tres mililitros de solución de Ringer con burbujas heladas frescas en una placa de disección cubierta de goma de silicona bajo un microscopio de disección y use los alfileres para asegurar los extremos de un segmento de tejido intestinal en el plato con el lado de la mucosa hacia abajo. Usando fórceps finos, diseccione sin rodeos la capa muscular de la mucosa subyacente, teniendo cuidado de no rasgar ni introducir ningún agujero en el tejido. Una vez que se haya eliminado la capa muscular, corte un trozo lo suficientemente grande como para una abertura de cinco milímetros de diámetro y coloque el tejido sobre un trozo de papel de filtro perforado de cinco milímetros húmedo con la solución de Ringer del lado de la mucosa hacia abajo utilizando un fondo negro para asegurarse de que la abertura en el papel de filtro esté completamente cubierta por el tejido sin arrugas.
Para montar las preparaciones intestinales en una cámara ussing, primero retire cualquier solución de la cámara antes de desmontarla. Coloque el papel de filtro con el lado de la mucosa de preparación intestinal hacia abajo en la cámara lateral de la mucosa utilizando las marcas negras para alinear la ventana de la cámara con el orificio en el papel de filtro. Conecte cuidadosamente la cámara lateral serosa a la cámara lateral mucosa sin mover la lámina intestinal.
Rellene rápidamente ambas cámaras con el tampón HEPES y coloque las burbujeantes en el extremo opuesto de cada cámara, lejos de la membrana. Vuelva a conectar los puentes de sal y verifique si el voltaje es estable, luego presione la corriente para asegurarse de que las conexiones estén bien antes de permitir que el sistema se equilibre durante aproximadamente 15 minutos. Para realizar un experimento de potencial de dilución, primero lave ambos lados de la cámara con cinco mililitros de tampón HEPES fresco precalentado por lado.
Encienda el sistema de grabación y ajuste el rango a 250 milivoltios. Establezca las posiciones del marcador, configure el sistema de grabación para medir y configure los sistemas de cámara Ussing en modo de abrazadera. Una vez que el potencial de medición se haya estabilizado, utilice los datos para las mediciones.
Reemplace rápidamente el tampón HEPES del lado de la mucosa de la cámara con cinco mililitros de tampón HEPES de dilución calentada complementado con cloruro de sodio 75 milimolar. Una vez que el potencial de membrana haya alcanzado su punto máximo, reemplace el tampón de dilución del lado de la mucosa con un tampón HEPES fresco. Para asegurarse de que el tejido es viable, agregue 10 micromolares de forskolina al lado serosal.
Una vez que la diferencia de potencial de la membrana ha alcanzado un pico y está comenzando a disminuir, el experimento ha terminado. Para medir la conductancia eléctrica transepitelial y la corriente de cortocircuito de referencia, después de lavar ambos lados de la cámara como se ha demostrado, agregue cinco mililitros de solución de Ringer de burbujas frescas a cada lado y ajuste el rango del sistema de grabación a 2,5 voltios. Establezca las posiciones del marcador, configure el sistema de grabación para medir y configure el sistema de cámara Ussing en modo de abrazadera.
Una vez que la corriente de cortocircuito y la conductancia se hayan estabilizado, use los datos para las mediciones de referencia. Para asegurarse de que el tejido es viable, agregue forskolina al lado serosal como se ha demostrado. Una vez que la diferencia de potencial de la membrana ha alcanzado un pico y ha comenzado a disminuir, el experimento ha terminado.
En este análisis representativo, la conductancia transmucosa basal del segmento medio del intestino delgado fue menor en los ratones knockout de claudina-15 en condiciones de cortocircuito en comparación con la observada en ratones de tipo salvaje, mientras que la corriente de cortocircuito basal fue mayor. Tras la dilución de cloruro de sodio luminal, se observó una diferencia de potencial positiva con respecto al lado serosal en ratones de tipo salvaje, pero la diferencia disminuyó en los ratones knockout de claudina-15. Del mismo modo, la permeabilidad relativa del cloruro de sodio también disminuyó en los animales knockout.
El cálculo de las permeabilidades absolutas reveló que la permeabilidad absoluta del sodio disminuyó en los ratones knockout de claudina-15, mientras que la permeabilidad absoluta del cloruro no lo hizo, lo que sugiere que la disminución en la permeabilidad relativa se debe a una disminución en la permeabilidad del sodio. Como era de esperar, la adición de forskolina al lado serosal de la cámara no causó una diferencia significativa en el cambio de corriente de cortocircuito entre los ratones knockout y de tipo salvaje. Dado que los segmentos intestinales demostraron una respuesta lo suficientemente grande a la forskolina, las preparaciones de membrana se consideraron viables.
Es importante realizar la eliminación adecuada de la capa muscular y asegurarse de que el tejido es viable. Enjuague la sección de disección de los ratones si la preparación es viable.
