Nuestra investigación se centra principalmente en la conexión entre la reparación del ADN y el envejecimiento. En concreto, analizamos diferentes trastornos de la laminopatía y queremos saber cómo pueden afectar a la reparación del ADN. Hemos demostrado que un trastorno de laminopatía asociado con el envejecimiento prematuro y una vida corta conocido como síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford en realidad se asocia con una mayor cantidad de daño en el ADN y una reparación imprecisa del ADN.
A nuestro laboratorio le gustaría investigar el efecto de las posibles terapias para los pacientes con laminopatía para saber si estos enfoques también tendrán un impacto positivo en la reparación y el daño del ADN. Para comenzar, coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una placa estéril de 6 pocillos con pinzas. Agregue dos mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium suplementado, o DMEM, a cada pocillo en la placa de 6 pocillos.
Aspirar el medio de las células HeLa cultivadas en el matraz y lavar las células añadiendo 15 mililitros de PBS. Agite el matraz suavemente para lavar las células, aspire el PBS y agregue dos mililitros de tripsina-EDTA para recubrir las células. Coloque el matraz cubierto con tripsina en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos minutos para permitir que las células se desprendan.
A continuación, añada ocho mililitros de DMEM suplementado al matraz que contiene las células tripsinizadas y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células aglomerantes. Recoja la suspensión de celdas del matraz en un tubo de poliestireno de 15 mililitros. Después de contar las celdas, agregue 500, 000 celdas gota a gota directamente en cada uno de los cubreobjetos en la placa de 6 pocillos.
Coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados para permitir que las células crezcan durante la noche. Para la fijación de la célula, aspire el medio de los pocillos de la placa de 6 pocillos al día siguiente. Agregue dos mililitros de PBS a cada pocillo para lavar las células y aspirar todo el PBS completamente de los pocillos.
Luego agregue dos mililitros de solución de formaldehído al 4% a cada pocillo durante 10 minutos a temperatura ambiente y aspire la solución completamente de los pocillos. A continuación, agregue dos mililitros de solución de permeabilización a cada pocillo. Deje reposar la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego aspire completamente.
Lave las células tres veces con dos mililitros de PBS en cada pocillo. Aspire completamente después de cada lavado. Una vez que se aspira todo el PBS de los pocillos, agregue dos mililitros de tampón diluyente de anticuerpos, o ADB, a cada pocillo para bloquear las células para la tinción de inmunofluorescencia.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con una suave agitación orbital. Hacia el final del período de bloqueo. Prepare la dilución de anticuerpos primarios mezclando lumen B1 y anticuerpos de ADN bicatenario en ADB.
Al final de la incubación, aspire el ADB de los pocillos. Pega con cinta adhesiva un pedazo de película de parafina sobre una superficie plana, asegurándote de que el área sea lo suficientemente grande como para acomodar todos los cubreobjetos que se están procesando. Para cada cubreobjetos, pipetee 75 microlitros de dilución del anticuerpo primario en la película de parafina evitando que se formen burbujas.
Con unas pinzas, coloque cada cubreobjetos con el lado de la célula hacia abajo sobre la gota de anticuerpo. Cubra los cubreobjetos de incubación con la tapa de la placa de 6 pocillos y deje que los cubreobjetos se incuben durante una hora a temperatura ambiente. Luego, con pinzas, retire con cuidado los cubreobjetos de la película de parafina y vuelva a colocarlos en la placa de 6 pocillos con el lado de la celda hacia arriba.
Lave los cubreobjetos agitándolos tres veces durante cinco minutos con dos mililitros de PBST. Durante el lavado final, prepare la dilución secundaria del anticuerpo. Después del último lavado, aspire PBST por completo.
Agregue un anticuerpo secundario a la película para y coloque los cubreobjetos sobre la película de parafina, con la célula hacia abajo. A continuación, coloque una cubierta protectora ligera sobre los cubreobjetos para proteger las células de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Con pinzas, retire con cuidado los cubreobjetos de la película de parafina y vuelva a colocarlos en la placa de 6 pocillos, asegurándose de que el lado de la celda esté hacia arriba, luego deshidrate los cubreobjetos agregando secuencialmente dos mililitros de 70%90% y 100% de etanol a los pocillos, permitiendo que cada solución repose durante uno o dos minutos antes de retirarla.
Con pinzas, retire los cubreobjetos de los pocillos y colóquelos en una toallita sin pelusa para que se sequen al aire, protegidos de la luz. Monte los deslizadores de la cubierta con el lado de la celda hacia abajo en portaobjetos de microscopio de vidrio usando 20 microlitros de medio de montaje por cubreobjetos. La ampolla nuclear fue más prevalente en las células HeLa ZMPST24 knockout, con aproximadamente el 50% de los núcleos que presentaban ampollas, en comparación con el 17% en las células de control HeLa.
La fuga de ADN se observó predominantemente en las células HeLa ZMPSTE24 knockout, mientras que no se observó fuga de ADN en las células de control HeLa, la fuga de ADN ocurrió en algunas células knockout ZMPSTE24, incluso en ausencia de ampollas nucleares visibles.
