يركز بحثنا بشكل أساسي على العلاقة بين إصلاح الحمض النووي والشيخوخة. على وجه التحديد ، ننظر إلى اضطرابات اعتلال الصفيحة الفقرية المختلفة ونريد أن نعرف كيف يمكن أن تؤثر على إصلاح الحمض النووي. لقد أثبتنا أن اضطراب اعتلال الصفيحة الفقري المرتبط بالشيخوخة المبكرة والعمر القصير المعروف باسم متلازمة هاتشينسون جيلفورد بروجيريا يرتبط في الواقع بزيادة كمية تلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي غير الدقيق.
يرغب مختبرنا في التحقيق في تأثير العلاجات المحتملة لمرضى اعتلال الصفيحة الفقرية لمعرفة ما إذا كانت هذه الأساليب سيكون لها أيضا تأثير إيجابي على إصلاح الحمض النووي وتلف الحمض النووي. للبدء ، ضع غطاء واحد في كل بئر من صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار باستخدام ملقط. أضف ملليلترين من Dulbecco's Modified Eagle Medium ، أو DMEM ، إلى كل بئر في اللوحة المكونة من 6 آبار.
استنشق الوسائط من خلايا HeLa المزروعة في القارورة واغسل الخلايا بإضافة 15 مل من PBS. قم بتدوير القارورة برفق لغسل الخلايا ، وشفط PBS ، وأضف ملليلترين من التربسين EDTA لتغليف الخلايا. ضع القارورة المغلفة بالتربسين في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين للسماح للخلايا بالانفصال.
ثم أضف ثمانية ملليلتر من DMEM المكملة إلى القارورة التي تحتوي على الخلايا المدرجة بالتربسين والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لفصل الخلايا المتكتلة. اجمع تعليق الخلية من القارورة إلى أنبوب بوليسترين سعة 15 ملليلترا. بعد عد الخلايا ، أضف 500 ، 000 خلية قطرة قطرة مباشرة على كل زلات من زلات الغطاء في لوحة 6 آبار.
ضع اللوحة في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالنمو بين عشية وضحاها. لتثبيت الخلايا ، قم بشفط الوسائط من آبار الصفيحة المكونة من 6 آبار في اليوم التالي. أضف ملليلترين من PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا وشفط جميع PBS تماما من الآبار.
ثم أضف ملليلترين من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ إلى كل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المحلول بالكامل من الآبار. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول النفاذية لكل بئر. اترك المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشقه تماما.
اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من PBS في كل بئر. استنشق بالكامل بعد كل غسلة. بمجرد شفط كل PBS من الآبار ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت المخفف للأجسام المضادة ، أو ADB ، إلى كل بئر لمنع الخلايا من تلطيخ التألق المناعي.
احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري لطيف. قرب نهاية فترة الحظر. تحضير تخفيف الأجسام المضادة الأولية عن طريق خلط التجويف B1 والأجسام المضادة للحمض النووي مزدوجة الشريطة في ADB.
في نهاية الحضانة ، استنشق ADB من الآبار. قم بلصق قطعة من فيلم البارافين على سطح مستو ، مما يضمن أن المساحة كبيرة بما يكفي لاستيعاب جميع زلات الغطاء التي تتم معالجتها. لكل زلة غطاء، ضع الماصة 75 ميكرولترا من تخفيف الجسم المضاد الأساسي على طبقة البارافين لتجنب أي فقاعات.
باستخدام الملقط ، ضع كل جانب من جوانب خلية الغطاء لأسفل على قطرة الجسم المضاد. قم بتغطية زلات غطاء الحضانة بغطاء اللوحة المكونة من 6 آبار واترك زلات الغطاء تحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم باستخدام الملقط ، قم بإزالة زلات الغطاء بعناية من فيلم البارافين وضعها مرة أخرى في اللوحة المكونة من 6 آبار بحيث يكون جانب الخلية متجها لأعلى.
اغسل زلات الغطاء عن طريق رجها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام ملليلترين من PBST. أثناء الغسيل النهائي ، قم بإعداد تخفيف الجسم المضاد الثانوي. بعد الغسيل الأخير ، استنشق PBST تماما.
أضف جسما مضادا ثانويا إلى الفيلم الجزئي وضع زلات الغطاء على فيلم البارافين ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل. ثم ضع غطاء واقيا خفيفا فوق زلات الغطاء لحماية الخلايا من الضوء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام الملقط ، قم بإزالة زلات الغطاء بعناية من فيلم البارافين وضعها مرة أخرى في اللوحة المكونة من 6 آبار ، مع التأكد من أن جانب الخلية متجها لأعلى ، ثم قم بتجفيف زلات الغطاء عن طريق إضافة ملليلترين بالتتابع لكل من 70٪ 90٪ و 100٪ من الإيثانول إلى الآبار ، مما يسمح لكل محلول بالجلوس لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل الإزالة.
باستخدام الملقط ، قم بإزالة زلات الغطاء من الآبار وضعها على منديل خال من النسالة لتجف في الهواء ، محمية من الضوء. قم بتركيب جانب الخلية المنزلق للغطاء لأسفل على شرائح المجهر الزجاجي باستخدام 20 ميكرولترا من وسط التركيب لكل زلة غطاء. كان الفقاع النووي أكثر انتشارا في خلايا HeLa ZMPST24 بالضربة القاضية حيث تظهر ما يقرب من 50٪ من النوى فقاعات ، مقارنة ب 17٪ في خلايا التحكم HeLa.
لوحظ تسرب الحمض النووي في الغالب في خلايا HeLa ZMPSTE24 بالضربة القاضية ، بينما لم يلاحظ تسرب للحمض النووي في خلايا التحكم في HeLa ، حدث تسرب الحمض النووي في بعض خلايا الضربة القاضية ZMPSTE24 ، حتى في حالة عدم وجود فقاع نووي مرئي.
