We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. Preparación de Medios, Reactivos y condiciones de cultivo celular <ol><li> 293 células de riñón embrionario humano HEK <ol><li> Cultura células HEK 293 (CRL-1573, ATCC) en medio F-12 DMEM / Ham suplementado con 5% de FCS, L-glutamina (2 mM), y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 g / ml). </li><li> Para el paso de las células, lavar las células una vez con PBS, añadir 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba durante 3 min a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g) y se transfieren unos 5x10 5 células en un matraz de cultivo T25 fresco. </li></ol></li><li> Fibroblastos embrionarios murinos (MEF) <ol><li> Añadir 1 ml de una solución de gelatina 0,1% a 6 pocillos individuales y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 1 hr. Aspirar el líquido y se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso. </li><li> Cultura MEFs en DMEM suplementado con 10% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glucosa (4,5 g / l), piruvato de sodio (1 mM), y penicilina (100 U /ml) / estreptomicina (100 mg / ml) en placas de 6 pocillos recubiertos de gelatina. </li><li> Distribuir MEFs en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. Añadir mitomicina (5 mg / ml) durante 2,5 horas para detener a las células. Medio Aspirar, lavar las células dos veces con medio MEF completa y añadir 3 ml de medio MEF a cada 6 pocillos. Estas células sirven como un alimentador de capa de células murinas y iPS porcinos. </li></ol></li><li> Cultura de ES murinos y células iPS <ol><li> Para preparar ratón medio de cultivo ES, complementar medio DMEM con 15% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glucosa (4,5 g / l), aminoácidos no esenciales MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) y el factor inhibidor de la leucemia (1.000 U / ml). </li><li> Enjuague 6-pozos con MEFs crecimiento detenido una vez con DMEM sin suero, añadir 2 ml de ratón ES medio y las células iPS murinas (20% de las células de un plato confluente). Cada día las células de lavado una vez con DMEM libre de suero y añadir 2 ml de ratón fresco medianas ES. </li><li> Para el paso de las células, lavar cada pocillo una vez con DMEM sin suero, añadir 00,25% de tripsina / EDTA y se incuba durante 3 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g), Resuspender las células en 500 l del ratón medio ES y añadir 100 l de la suspensión de 2 ml ratón medio ES en un fresco 6 pocillos con una MEF alimentador de capas. </li></ol></li><li> Cultura de cerdo células iPS <ol><li> Para preparar cerdo medio iPS, complementar DMEM / Ham F-12 medio con 20% de suero de knockout, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM), y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 g / ml). Filtrar a través de un filtro de 0,22 M y se almacena a 4 ° C durante 2 a 3 semanas. Tras la primera utilización, añadir bFGF (10 ng / ml de concentración final). </li><li> Enjuague 6-pozos con MEFs crecimiento detenido una vez con DMEM libre de suero / F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo iPS medio de Ham y porcina células iPS (10% de las células de un plato confluente). Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / Ham F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo fresca medianas iPS. </li><li> Para preparar tampón de disociación añadir 2,5% de tripsina, colagenasa IV (10 mg / ml), suero knockout (20%) y CaCl 2 (1 mM) para Ca 2 + libre de PBS. Lavar las células dos veces con PBS y se incuban con tampón de disociación durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g). </li><li> Resuspender las células iPS de porcino en 500 l fresca de cerdo medio iPS y añadir 50 l de la suspensión a 1,5 ml de cerdo medio iPS en un nuevo máximo de 6 pocillos con un alimentador de capa MEF. Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / de Ham F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo fresca medio iPS. </li></ol></li><li> Cultura-alimentador libre de células iPS humanas <ol><li> Descongelar el vial original que contiene la preparación de la membrana basal a 4 ° C y se diluye con enfriado con hielo libre de suero DMEM / Ham F-de 12 a 8 mg / ml, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Descongelar una alícuota de la basepreparación de membrana ción a 4 ° C y se diluye con DMEM / F12 de Ham enfriado con hielo libre de suero (90 mg / ml). Pipetear 1 ml de esta solución en placas de cultivo de 3 cm y agitar suavemente para asegurar que toda la superficie está cubierta. Selle platos con parafilm y se almacena a 4 ° C durante un máximo de una semana. Antes de la utilización para el cultivo celular incubar platos para 30 min a 37 ° C o 3 horas a RT para permitir la polimerización de la preparación de la membrana basal. </li><li> Aspirar medio de los platos recubierto con la preparación de la membrana basal y lavar dos veces con DMEM libre de suero / Ham F-12. Añadir 1,5 ml de medio E8 a la placa de cultivo y las células iPS humanas (10% de las células de un plato confluente). Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / F-12 y añadir 1,5 ml de medio E8 fresca de Ham. </li><li> Para el paso de las células, lavar los platos dos veces con PBS y se añade 1 ml de PBS / EDTA 0,5 mM. Incubar los platos durante 5 min a RT. Monitorear las células bajo un microscopio. Nota: Cuando las colonias comienzan a redondear y appear tener agujeros que están listos para la transferencia. </li><li> Aspirar el líquido, añadir 1,5 ml de medio E8 y separar las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. La transferencia de células a un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g), resuspender en 500 l medio E8 y añadir 50 l de la suspensión a 1,5 ml de medio E8 en una placa de cultivo fresco recubierto con la preparación de la membrana basal . </li></ol></li></ol> 2. Diseño de Target-secuencias entre especies Fronteras <ol><li> Seleccione secuencias de cDNA porcino de los genes diana (GAPDH, NANOG, GDF3) humana de referencia, y murino y realizar un análisis de la alineación de múltiples secuencias CLUSTAL. Nota: Esto indicará las secuencias homólogas entre especies. <ol><li> Utilice los siguientes valores para la alineación múltiple: penalización por hueco (fijo) 10, penalización por hueco (variable) 5, la transición ponderación 0, rango de pena de la separación brecha de 8,% de identidad en caso de retraso 40, número máximo de iteraciones a realizar 3. </li></ol></li><li> Enviar secuencias diana deseados al fabricante (véase la Tabla de Materiales) para el diseño de la sonda y la fabricación. Nota: El fabricante se confirme la compatibilidad de secuencia deseada con la tecnología. Si secuencia deseada no es compatible, el fabricante sugiere secuencias alternativas. <ol><li> Asegurar que las regiones homólogas que pueden ser utilizados como posibles secuencias de la cadena de captura tienen una longitud de 27 pb. Nota: Es aconsejable pedir varias nanopartículas con diferentes líneas de captura para un gen diana seleccionada, ya que sólo el experimento celular verdadera dará una prueba definitiva de la funcionalidad de una secuencia individual. Por lo tanto, se evaluaron dos secuencias diferentes para GAPDH y GDF3 mientras que tres diferentes nanopartículas se ensayaron para evaluar la expresión NANOG. Su ubicación y las secuencias exactas han sido publicados en otra parte 17. El fabricante fabrica comercialmente el nanopartículos con secuencias deseadas y les proporciona en formato liofilizado. </li></ol></li></ol> 3. La reconstitución de nanopartículas y adición de Cultivos Celulares <ol><li> Guarde nanopartículas liofilizadas sobre el recibo a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Reconstituir las nanopartículas mediante la adición de 50 l de agua doble destilada que da una concentración final de 100 nM. Una vez reconstituido tienda nanopartículas a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: En esta condición son estables durante al menos un año. Almacenamiento de muestras reconstituidas a 4 ° C puede afectar negativamente a su estabilidad. </li><li> Pre-diluir la solución de nanopartículas de valores con PBS a una concentración de 2 (células HEK 293) o de 8 Nm (iPS y las células madre embrionarias) en el día de la solicitud. Nota: Esta concentración es 20 veces mayor que la concentración final en la placa de cultivo. En las células ES y células iPS, 400 pM de nanopartículas indujo una señal fluorescente fácilmente detectable bajo el microscopio. Para las células HEK 293, aconcentración de 100 pM es suficiente. </li><li> Pipetear 12,5 l de nanopartículas prediluidas a un 237,5 l medio de cultivo celular completa de 24 pocillos que contiene. Para los pozos de diferentes tamaños, ajustar los volúmenes en consecuencia. Agite la placa cuidadosamente para garantizar la igualdad de la distribución de las nanopartículas. Se incuban las células durante la noche (O / N) a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado. </li><li> Al día siguiente, los cultivos celulares para analizar genes específicos de Cy3 fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 546 nm (emisión de 575 a 640 nm) bajo un microscopio de fluorescencia. Nota: El periodo requerido para obtener una suficientemente fuerte fluorescencia puede depender del tipo de célula y el gen diana. En estos experimentos, esto se observó entre 16 y 20 horas después de la aplicación de la sonda. </li></ol> 4. Identificación de Cy3 positivos celulares Poblaciones por Citometría de Flujo <ol><li> Crecer HEK 293 o células madre embrionarias murinas utilizando las condiciones especificadas en el apartado 1.1 o 1.3, respectively. Un día antes de la FACS análisis de añadir GAPDH específicos de nanopartículas a diferentes concentraciones de células HEK 293 (véase la Figura 6A) y en 400 pM para las células ES murinas. Se incuban las células O / N a 37 ° C y 5% de CO2 en una atmósfera húmeda. </li><li> Analizar los cultivos celulares para la fluorescencia inducida por Cy3-gen específico bajo un microscopio de fluorescencia. </li><li> Separe células HEK 293 como se especifica en el punto 1.1.2. Centrifugar, transferir a un tubo de 1,5 ml y resuspender en 200 l PBS enfriado con hielo / 0,5% BSA / 2 (tampón FACS) mM EDTA. Mantenga celdas oscuras en hielo hasta que el análisis de citometría de flujo. </li><li> Separe las células ES murinas como se especifica en el punto 1.3.3. Centrifugar, transferir a un tubo de 1,5 ml y resuspender en 200 l PBS enfriado con hielo / 0,5% de BSA / EDTA 2 mM. Mantenga celdas oscuras en hielo hasta que el análisis de citometría de flujo. </li><li> Pulse las células a través de un filtro de 30 micras para prevenir la agregación de células y añadir yoduro de propidio (concentración final 2 mg / ml) 2 minantes del análisis FACS para excluir las células muertas. </li><li> Para analizar las células Cy3-positivos primera establecidos puertas jerárquicos en la FSC-A / SSC-Un subconjunto, la FSC-H / FSC-W-subgrupo y el subgrupo SSC-H / SSC-W. Utilice el avance y la dispersión lateral para excluir los desechos celulares y células que no se encuentran dispersos. Excluir las células muertas por su tinción con yoduro de propidio mostrar PE contra PE-Texas Red. Realizar la puerta tipo final sobre células Cy3-PE positivos (Figura 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+rhesus+monkey+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+leukemia+inhibitory+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor-dependent+induced+pluripotent+stem+cells+from+canine+adult+somatic+cells.">Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+ovine+adult+fibroblasts+to+pluripotency+via+drug-inducible+expression+of+defined+factors.">Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors.</a> Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).</li><li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+Tibetan+miniature+pig.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig.</a> J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).</li><li>Maekawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+somatic+cells+is+promoted+by+maternal+transcription+factor+Glis1.">Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1.</a> Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).</li><li>Marti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+gingival+fibroblasts+and+periodontal+ligament+fibroblasts.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts.</a> J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).</li><li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells.">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li><li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells.">Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).</li><li>Kang, N. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+staining+and+sorting+with+the+live-cell+fluorescence+imaging+probe+CDy1.">Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).</li><li>Ban, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+cardiomyocytes+from+differentiating+pluripotent+stem+cells+using+molecular+beacons+targeting+cardiomyocyte-specific+mRNA.">Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA.</a> Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).</li><li>Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares:+probes+for+transfection+and+mRNA+detection+in+living+cells.">Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).</li><li>Lahm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fluorescent+RNA-based+detection+of+pluripotency+gene+expression+in+embryonic+and+induced+pluripotent+cells+of+different+species.">Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species.</a> Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).</li><li>Clark, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NANOG+and+GDF3+genes+are+expressed+in+pluripotent+cells+and+map+to+chromosome+12p13,+a+hotspot+for+teratocarcinoma.">NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma.</a> Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).</li><li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart.">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Yue, T., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effect+in+receptor-mediated+endocytosis+of+multiple+nanoparticles.">Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles.</a> ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).</li><li>Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+particles+by+peripheral+dendritic+cells.">Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells.</a> Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).</li><li>Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares+for+mRNA+regulation+and+detection.">Nano-flares for mRNA regulation and detection.</a> ACS Nano. 3 (8), (2009).</li><li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-trafficking+of+hERG+reverses+long+QT+syndrome+2+phenotype+in+human+iPS-derived+cardiomyocytes.">Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).</li><li>Seftor, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+tumor+cell+heterogeneity:+a+molecular+approach+to+study+subpopulations+expressing+the+embryonic+morphogen+Nodal.">Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal.</a> Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).</li><li>Khare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain-only+protein+POP3+inhibits+ALR+inflammasomes+and+regulates+responses+to+infection+with+DNA+virus.">The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus.</a> Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).</li><li>Kratz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+expression+profiling+of+the+compartmentalized+translatome+of+Purkinje+neurons.">Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons.</a> Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).</li></ol>

HL ha recibido las nanopartículas de EMD Millipore Corporation de forma gratuita. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

El presente trabajo describe el uso de marcado con fluorescencia nanopartículas que permiten la evaluación fiable de la expresión génica intracelular directamente en células vivas de diferentes especies de mamíferos con diverso origen histogenético bajo un microscopio de fluorescencia. Este enfoque tiene un par de ventajas en comparación con otros métodos publicados. En primer lugar el investigador no está limitado con respecto a cualquiera de los genes diana o tipo de célula. Todos los métodos de detección de anticuerpos basados ​​están restringidas a un solo epítopo. Aunque fluorescentes balizas moleculares también pueden diseñarse para un amplio espectro de genes, este método requiere la disociación de las células y la posterior nucleofection 15. En contraste, la aplicación de nanopartículas de genes específicos no requiere ningún tipo de manipulación de la célula diana que envuelve las nanopartículas activamente por endocitosis. Durante la posterior pases las partículas de oro dejan gradualmente las células y el cultivo se pueden utilizar en downstream experimentos. Sin embargo, la tecnología también todavía tiene algunas limitaciones. Algunos marcadores, obviamente, no son detectables debido a su naturaleza carbohidrato tal como SSEA-1 o TRA-1-81 20. En la actualidad, una gran variedad de nanopartículas está disponible comercialmente. Estas partículas han sido previamente probado por su funcionalidad en los experimentos celulares. El objetivo del presente trabajo fue diseñar sondas personalizadas que se pueden utilizar en todas las especies de las fronteras. Al seguir este tipo de enfoque o en el diseño de una sonda para un nuevo gen diana uno tiene que ser consciente de que la funcionalidad de un in silico predijo la sonda debe ser evaluado a fondo en vitro. La sonda NANOG-SF3 que mostró una homología del 100% a la homología de secuencia no funcionaba en absoluto mientras NANOG-SF1 con una sola base de no coincidentes en el murino y secuencia porcina produce una señal de fluorescencia agradable. Otra cuestión se refiere a la absorción eficiente de las nanopartículas. Las partículas entranlas células por endocitosis, un proceso que está influenciada por el tamaño de las nanopartículas 21, el tipo de célula y el estado de diferenciación 22 y la capacidad celular para llevar a cabo phago- y macropinocitosis 23. La concentración óptima para obtener una señal de fluorescencia satisfactoria tiene que ser probado para cada aplicación individual o línea celular. Con ese fin, el primer experimento debe ser siempre la aplicación del control captación para evaluar la compatibilidad de las sondas dentro de los tipos de células y condiciones de cultivo antes de pasar a la detección específica de la diana de la expresión génica. Un punto fundamental para obtener resultados fiables al aplicar este protocolo para una novela línea celular o población celular es la inclusión de controles adecuados. El control de la captación de fluorescencia nunca proporcionará un indicio que las concentraciones de nanopartículas inducirán una señal fluorescente suficiente en la población de células diana. La fluorescencia se debe evaluard al día siguiente ya que la señal se desvanecerá con el tiempo 17. Al mismo tiempo el control scramble sin una contraparte en el genoma eucariótico aplicado a una concentración idéntica debe inducir una señal de fondo despreciable. Como tercera de control, es aconsejable utilizar una nanopartícula específico para un gen de mantenimiento (por ejemplo, GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas sirven como un control positivo que el enfoque se puede utilizar para detectar la expresión de genes específicos en la población celular diana seleccionada. Si estos controles resultan satisfactorias se puede esperar obtener señales fluorescentes específicas fiables utilizando nanopartículas específicas para otros genes diana. La concentración de las nanopartículas aplicadas también puede ser crítico, ya que se ha demostrado que regular a la baja la secuencia diana 24. Sin embargo, este efecto requiere concentraciones mucho más altas (5 nM) que las concentraciones utilizadas en los experimentos presentados aquí (400 pM). A esta concentración la nanoflares no afectan ARNm objetivo gen o los niveles de proteína y concentraciones de hasta 2 nM no perjudiquen la proliferación de las células HEK293 y células madre embrionarias murinas 17. Además, un análisis de la expresión del genoma completo no reveló cambios significativos en la expresión génica 25. Por lo tanto, en concentraciones de hasta 1 nM las nanoflares no deberían exhibir efectos adversos importantes. Una aplicación muy prometedor de esta tecnología es la posibilidad de etiquetar cualquier población de células dada que está marcado por un gen específico. Recientemente, las nanopartículas de genes específicos de éxito han sido utilizados para teñir selectivamente miocitos ventriculares en vivo 26, subpoblaciones de células de melanoma 27, monocitos y células cerebelosa 28 culturas 29. Tales poblaciones de células de fluorescencia de marcado pueden ser ordenados y se purificaron por citometría de flujo como células vivas. En el campo de la oncología es imaginable para aislar las células tumorales metastásicas en vivo en modelos animalesen base a su expresión de CEA, más valioso para la búsqueda de metástasis potencial de promoción de genes o estructuras diana. Recientemente hemos demostrado que las colonias iPS murinas verdaderamente reprogramadas pueden ser identificados in situ con Nanog específicos de nanopartículas basadas en la intensidad de fluorescencia detectada 17. Por lo tanto, la identificación de las colonias de iPS reprogramadas verdaderamente se podría realizar en las plataformas de alto rendimiento, que utilizan la detección de fluorescencia robótica y los dispositivos de picking para identificar las colonias más prometedores. Esta tecnología parece ser adecuada en muchas áreas de investigación para seleccionar subpoblaciones celulares específicos y parece posible aplicar las nanopartículas en plataformas de alto rendimiento. En conclusión, este protocolo representa un nuevo enfoque marcado con fluorescencia usando nanopartículas que permite la detección de la expresión génica intracelular directamente en células vivas. Esta tecnología puede ser una herramienta valiosa para purificar, ampliar y más carácterize subpoblaciones celulares raras en muchas áreas de investigación.

En 2006, un nuevo enfoque fue descrito para reprogramar células somáticas en un estado pluripotente. Después de la preselección de una matriz de potencial reprogramación factores de fibroblastos murinos se podrían convertir con éxito a la denominada células madre pluripotentes inducidas (iPS) por transducción retroviral y la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efectivamente se ha reproducido utilizando células somáticas de las diferentes especies de mamíferos, incluyendo seres humanos 2, monos, ratas 3 4, 5 perros, ovejas y cerdos 6 7. Además, modificado protocolos omitir o sustituir el factor de transcripción c-MYC potencialmente oncogénico se han publicado 8, 9. Independientemente de la reprogramación inicial de acercarse a la verdad pluripotencia de las colonias en crecimiento tiene que ser confirmado, una tarea laboriosa y requiere mucho tiempo. Un inconveniente importantede la mayoría de estos análisis es que no se pueden realizar en células vivas. Factores de pluripotencia establecidos, tales como Oct4, Sox2, NANOG o REX1 representan factores de transcripción localizados en el núcleo y su detección requiere la fijación de las células antes de la inmunohistoquímica o la lisis celular para el análisis de RT-PCR 10 -. 12 Después de esto, estas células se pierden para el futuro experimentos que requieren cultivos replicados de cada colonia. Por lo tanto, una tecnología para analizar la pluripotencia en células vivas es altamente deseable. Varios enfoques de hecho se pueden realizar directamente en células vivas utilizando anticuerpos dirigidos contra antígenos basados ​​en membranas (por ejemplo. TRA-1 a 60, SSEA4) 12, fluorescente informó colorantes para detectar fosfatasa 13 o moléculas pequeñas alcalinos que etiquetan específicamente madre embrionarias (ES) y las células iPS 14. Sin embargo, los anticuerpos pueden, sin embargo, afectar adversamente a las células y cada metod está restringido a un único marcador de pluripotencia. Por último, las balizas moleculares fluorescentes, los oligonucleótidos de doble antisentido con estructuras de horquilla, que permiten tinción en vivo de las células, se han descrito 15. Aunque este enfoque puede ser aplicado a muchos genes, la técnica requiere nucleofection de una única suspensión celular, que no es aplicable a las crecientes iPS colonias. Hace un par de años las nanopartículas de genes específicos se han descrito para analizar la expresión de survivina en células de cáncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito describe un nuevo enfoque innovador para la detección de marcadores de pluripotencia en ES vivos y las células iPS a través del uso de conjugados de nanopartículas de oro. Estas nanopartículas se componen de una partícula central de oro con una cadena de captura unido lleva la secuencia de ARN complementaria y una hebra reportero marcado con Cy3. La señal fluorescente de la hebra reportero se inactivó mediante la partícula de oro central. Además, apropiadonanopartículas sirven como controles negativos y positivos, respectivamente (Figura 1). Para una aplicación de las nanopartículas simplemente se añaden al medio de cultivo (Figura 2) y entran en las células a través de endocitosis (Figura 3). Si se expresa el ARN diana que desplaza la hebra reportero que entonces emite una señal fluorescente. Este método no requiere la manipulación de la célula diana y la expresión del gen diana se puede monitorizar ópticamente bajo un microscopio de fluorescencia directa en células vivas. Además, la tecnología se puede aplicar a cualquier gen diana deseada a través de especies en el caso de las células iPS y por lo tanto se puede emplear en muchas áreas de investigación diferentes. Finalmente, los análisis de citometría de flujo permite la identificación y el enriquecimiento de células positivas Cy3.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

En un primer intento de verificar y comprobar la detección intracelular de expresión de genes específicos en células vivas utilizando nanopartículas decidimos realizar experiencias piloto utilizando un gen casa de mantenimiento de constitutivamente expresado (GAPDH) en células 293 HEK humano. La concentración de las nanopartículas utilizadas en estos experimentos fue elegido de acuerdo a la recomendación del fabricante. La adición de una sonda específico de GAPDH al medio de cultivo a una concentración final 100 pM indujo una clara Cy3-fluorescencia en estas células, que era visible bajo un microscopio de fluorescencia después de la incubación O / N (Figura 5A). Dos controles se incluyeron en estos experimentos para corroborar el resultado. Uno de control comprende de un denominado nanopartícula &quot;scramble&quot;, donde la hebra reportero no tiene una secuencia coincidente en células de mamífero o eucariotas. La nanopartícula &quot;scramble&quot; determina el fondo inespecífico fluorescence debido a la posible degradación de la sonda o de temple incompleta de la fluorescencia. La adición de la sonda scramble produjo una única señal marginal fluorescente, que es insignificante (Figura 5B). Un control &quot;absorción&quot; fluorescente de forma permanente ayuda a determinar la capacidad de las células para incorporar las nanopartículas por endocitosis que puede variar entre los diferentes tipos de células. Estas partículas de control positivo produjeron una señal fluorescente brillante en células HEK 293 (Figura 5C). Por lo tanto, se confirmó la viabilidad de la tecnología para grabar una señal fluorescente específica de un gen intracelular con una señal de fondo despreciable. Se debe mencionar que la diferencia entre la señal de fondo y la fluorescencia específica disminuye con el tiempo. Los aumentos de fondo debido a la sonda degradación o extinción incompleta mientras que la fluorescencia específica se desvanece poco a poco (Figura 5D). Las mismas nanopartículas específicos de GAPDH tienenha probado en cultivos de fibroblastos primarios de murino, porcina y ovina origen 17. Estas células producen una señal de fondo mucho más alto que las células HEK 293, mientras que la fluorescencia específica de la diana es más bien débil, posiblemente debido a la relativamente baja capacidad proliferativa de estos cultivos. Estas experiencias piloto nos llevó a usar esta tecnología para la detección de la expresión de genes pluripotencia en células iPS derivadas de diferentes especies. Para este propósito se analizaron NANOG y GDF3, ambos de los cuales se sabe que se expresa en las células pluripotentes 18. Al principio, las células iPS derivadas de fibroblastos punta de la cola de un promotor cardiaca línea de ratones transgénicos Nkx2.5 19 fueron investigados. Para ambos genes se obtuvo una señal fluorescente fuerte (Figura 6A) y una insignificante Cy3-fluorescencia del control scramble (datos no mostrados). Resultados similares se obtuvieron en células iPS humanas y porcinas (Figura 6B y C). Es importante destacar que la señal de fluorescencia fue restringido a las colonias iPS y no etiquetar los fibroblastos utilizados como una capa de alimentación para ratón y iPS porcina (ver flechas en la Figura 6A y C). El análisis de la expresión génica NANOG también reveló que no todos secuencia prevista en silico para ser &quot;buena&quot; por fin es funcional. Uno de los tres diseños de un NANOG específicos de nanopartículas inducidas casi no hay señal fluorescente comparable a la del control scramble a pesar de un 100% de coincidencia de secuencia en las células iPS murinos (Figura 6D). Un resultado similar se obtuvo en células iPS de origen porcino y humano con esta sonda (datos no mostrados). Por lo tanto, las nanopartículas se pueden usar para detectar la expresión de genes a través de especies pluripotencia fronteras mientras que la funcionalidad de cada sonda diseñada solo necesita ser evaluado de antemano. Los prometedores resultados de la in situetiquetado de células vivas en placas de cultivo celular nos llevó a analizar la expresión génica cuantitativamente por citometría de flujo. Con este fin se añadieron nanopartículas específicos de GAPDH en concentraciones graduadas a HEK 293 monocapas con el fin de comparar la eficiencia de etiquetado dentro de la población de células diana. Según la evaluación realizada por microscopía fluorescente una fluorescencia inducida por Cy3 mejorada fue visto con la concentración más baja en comparación con células que no recibieron las nanopartículas. Concentraciones crecientes de las nanopartículas indujeron una fluorescencia depende claramente concentración de células HEK 293 in situ (Figura 7A). Someter a estas células a un análisis de citometría de flujo confirmó la eficacia de marcado dependiente de la concentración. La frecuencia de células positivas Cy3 aumentó significativamente (más de siete veces) cuando la concentración más alta de nanopartículas se aplicó (Figura 7B). En otros experimentos ES células de la cardiaco Nkx2.5potenciador de la línea de ratones transgénicos 19 se utilizaron para analizar la expresión de genes de pluripotencia por citometría de flujo. Experiencias piloto con 400 pM del control captación positiva rindieron claramente Cy3 ES vivo colonias positivas en el microscopio y citometría de flujo detecta casi el 40% de las células positivas Cy3 (Figura 7C). En contraste, comparable a las células no tratadas aproximadamente 0,1% de células tratadas con el scramble manchado positivo (datos no mostrados). Del mismo modo la adición de nanopartículas específicos para GAPDH, Nanog y GDF3 induce una señal de fluorescencia distinta en colonias individuales en la placa de cultivo celular. La frecuencia de células positivas para Cy3 Gapdh como se determinó por citometría de flujo fue comparable a la observada para ambos genes pluripotencia (Figura 7C). Este resultado es esperable como también se cree Nanog y GDF3 que se expresa constitutivamente en células madre embrionarias pluripotentes. Por lo tanto, estos datos claramente indiCate que las células que expresan un gen en particular se pueden identificar por análisis de citometría de flujo, cualitativamente y por su cantidad relativa. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Figura 1: Representación esquemática de la estructura de las nanopartículas. (A) Estructura de una nanopartícula-gen específico. (B) nanopartículas Scramble (control negativo). (C) La captación de nanopartículas (control positivo). Adaptado de Lahm et al. 17, reimpreso con el permiso de Wiley. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Figura 2: Aplicación de nanopartículas a los cultivos celulares Una solución adecuadamente diluida de nanopartículas se pipetea simplemente al medio de cultivo.. Después de O / incubación células fluorescentes específicos del gen N son visibles bajo af<html> microscopio luorescent. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Figura 3:. La absorción activa de nanopartículas por las células a través de endocitosis (A) Las células fagocitan activamente las nanopartículas por endocitosis (B) mRNA diana se une a la cadena de captura y desplaza el reportero fluorescente.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Figura 4: Estrategia de apertura de puerta para citometría de flujo. (A) Estrategia para HEK 293 células. (B) Estrategia de células madre embrionarias murinas. Los datos fueron adquiridos mediante dispositivo 1 para las células HEK 293 o dispositivo 2 de células madre embrionarias murinas y se analizaron posteriormente por una herramienta de software (véase la Tabla de Materiales). /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Análisis de GAPDH-expresión en células HEK 293 Una nanopartícula específico de GAPDH se añadió a las células a 100 pM (concentración final) y la fluorescencia se registró después de O / N de incubación (A) GAPDH nanopartícula específico de (B.. ) Scramble (control negativo). (C) Captación (control positivo). (D) Cinética de scramble y el control de la absorción. La fluorescencia se determina en los puntos de tiempo indicados después de la adición de nanopartículas específicos de GAPDH. Las barras de escala representan 50 micras. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Figura 6:. Análisis de Pluripotencia expresión génica en células iPS de especies diferentes nanopartículas específico para NANOG o GDF3 se añadieron a las células a 400 pM (conce definitivantration) y la fluorescencia se registró después de O / N de incubación. () Las células iPS murino A. (B) células iPS humanas. (C) células iPS porcino. Las flechas en (A) y (C) designan células alimentador de capa de fibroblastos no marcado. (D) de la fluorescencia en las células iPS murinos después de la adición de la NANOG-diseño SF3 nanopartícula. Las barras de escala representan 50 micras. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Figura 7: nanopartículas Etiquetada células vivas pueden ser identificados por citometría de flujo. (A) vista microscópica de Cy3 HEK positivo 293 células después de la adición de diferentes concentraciones de nanopartículas. (B) Frecuencia de células positivas Cy3 determinados por citometría de flujo. (C) tinción vivo de murinos colonias de células ES y la determinación de la frecuencia de Cy3 positivo las células. Se añadieron nanopartículasa una concentración final de 400 pM. Las barras de escala representan 50 micras.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles at JoVE.com

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

detection-intracellular-gene-expression-live-cells-murine-human

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vistas.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Video: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...