Nuestra investigación o investigación principal se centra en la diversidad microbiana, la filogenómica y las aplicaciones de fermentación, haciendo hincapié en la diversidad de levaduras, las adaptaciones y, específicamente, en la aplicación industrial de la biología de la levadura. Específicamente yendo a esas aplicaciones, estudiamos la eficiencia de la fermentación, la producción de sabor y la tolerancia al estrés en la levadura. Por lo tanto, nuestros avances más recientes están relacionados con la filogenómica de levaduras, particularmente de la Patagonia.
Luego usamos esto para generar una nueva levadura lager para la fermentación de la cerveza, pero también estamos usando levadura nueva para la cerveza de bajo contenido alcohólico. En conjunto, utilizamos diferentes técnicas ómicas y evolución experimental para desarrollar esta novedosa levadura para aplicaciones biogenológicas. Actualmente estamos utilizando diferentes técnicas como la secuenciación del genoma, la secuenciación del genoma de lectura larga y también la transcriptómica.
Luego, en conjunto, usamos esta información para hacer una evolución experimental de las diferentes cepas que tenemos, y luego tratamos de validar algunos de los cambios genómicos utilizando técnicas CRISPR o diferentes técnicas de transformación de levaduras, y de esa manera entramos en los detalles moleculares de la adaptación de la levadura a los ambientes fermentativos. Por lo tanto, tenemos dos grandes desafíos. Uno es generar levadura lager novedosa con una fermentación eficiente de la cerveza, y otro es todo lo contrario.
Queremos obtener cepas novedosas, particularmente de la Patagonia, que sean capaces de generar cerveza de bajo contenido alcohólico. Destacaría dos resultados principales de nuestro laboratorio. Una de ellas es que identificamos un origen extrapatagónico de la madre de la levadura lager, Saccharomyces eubayanus.
Y ahora también hemos generado docenas de nuevos híbridos de lager para la fermentación de cerveza. Creo que esos son los dos hallazgos principales de nuestra investigación. Para comenzar, elija una muestra de un parche de cepa de levadura transformada e inocule en un medio de peptona de levadura que contenga 5% de glucosa y 200 micromolares de higromicina.
Incubar el cultivo a 25 grados centígrados sin agitar durante 24 horas. Refresque los cultivos en medio fresco en una dilución de 1 a 10 antes de incubar durante otras 24 horas. Lave las células con un medio de peptona de levadura sin azúcar, luego inólelas en el medio de prueba en una dilución de 1 a 10.
Complemente el medio de prueba con luciferina hasta una concentración final de 3 milimolares y con higromicina de 200 micromolares para mantener la estabilidad del plásmido. Para las pruebas de crecimiento de azúcares mixtos, utilice una matriz de glucosa-maltosa con concentraciones crecientes de glucosa y maltosa en el medio de peptona de levadura. Dispense 200 microlitros de cultivo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Ahora use un lector de placas luminométricas para medir la luminiscencia y la densidad óptica a 620 nanómetros cada 30 minutos durante 72 horas. Establezca el tiempo de integración en un segundo y deshabilite la atenuación para garantizar la actividad continua del reportero y el monitoreo de la densidad de celdas. Para el muestreo de fermentación y el control de luminiscencia, primero disuelva el extracto de malta en agua para preparar el medio de extracto de malta.
Pre-cultivo de cepas de levadura transformada en 5 mililitros de medio YPD a 20 grados Celsius con agitación a 200 RPM durante 24 horas. Transfiera el precultivo a 50 mililitros de medio de extracto de malta, luego incube a 20 grados centígrados con agitación a 200 rotaciones por minuto durante otras 24 horas. Centrifugar el cultivo a 21,380 G durante un minuto a temperatura ambiente para recolectar las células.
Luego resuspenda las células en una placa de 12 grados de medio de extracto de malta por triplicado para microfermentaciones de 50 mililitros. Complemente el medio con 0,3 miligramos por litro de cloruro de zinc para mejorar el rendimiento de la fermentación. Calcule el volumen de inóculo para garantizar densidades celulares consistentes en todas las réplicas.
Inocular el medio preparado con la cantidad calculada de inóculo. Luego coloque los cultivos a 20 grados centígrados sin agitar durante 14 días. Controle el progreso de la fermentación registrando el dióxido de carbono perdido diariamente.
Pesar los recipientes cada día para medir la pérdida de peso acumulada como indicador de la producción de dióxido de carbono. Para el control de la luminiscencia, muestree periódicamente 200 microlitros de cada microfermentación. Agregue luciferina para lograr una concentración final de 3 milimolares.
Mida la luminiscencia y la densidad óptica a 620 nanómetros utilizando un lector de placas luminométricas sin atenuación y un segundo de tiempo de integración. El plásmido reportero episomal pRS426-PMAL32-LUC-HphMX se construyó con éxito con el promotor de PMAL32 luciferasa ORF y casete hphMX. Se observó actividad diferencial de luciferasa entre las tres cepas transformadas bajo concentraciones variables de glucosa y maltosa.
CBS12357T y CL467.1 mostraron activación sin glucosa, mientras que QC18 requirió una concentración de glucosa superior al 1% para la activación. En condiciones de microfermentación, las tres cepas transformadas demostraron un fuerte pico de luminiscencia en diferentes momentos. La luminiscencia estuvo ausente en las cepas de tipo salvaje.
