Este protocolo nos permite explorar fácilmente las características epigenéticas de la enfermedad neurodegenerativa. La principal ventaja de esta técnica es que explota la levadura como sistema modelo, en comparación con otros modelos celulares y animales de enfermedad neurodegenerativa, la levadura es conveniente y rentable. Esta técnica nos permite trazar los cambios epigenéticos que surgen en la enfermedad neurodegenerativa, lo que puede dar lugar a nuevos marcadores para el diagnóstico, así como nuevos objetivos para la terapia.
Este método permite una mayor investigación del papel de las marcas epigenéticas en la enfermedad neurodegenerativa y puede modificarse para la evaluación de fibroblastos humanos y células madre pluripotentes inducidas. Este método en particular contiene una serie de detalles que deben demostrarse visualmente, como la carga adecuada del aparato de manchas occidentales. Demostrarán el procedimiento Michel Fallah y Navin Rana, ambos investigadores de grado en el laboratorio Torrente.
Comience por restar levadura de las poblaciones congeladas de glicerol en placas medianas selectivas de agar de histidina 2%, para una incubación de dos a tres días a 30 grados centígrados. Al final de la incubación, inocular levadura restreaked para cada modelo de expresión y control en cinco mililitros de medio líquido selectivo de histidina. Suplementado con 2%rafiné a 30 grados Celsius y 200 rotaciones por minuto, durante la noche.
A la mañana siguiente, crecen 100 mililitros de cultivo líquido para cada uno de los modelos de sobreexpresión y controles en medios selectivos complementados con 2%gatactosa durante la noche. Y mida la densidad óptica a 600 nanómetros o OD600 para determinar el volumen de cultivo nocturno necesario para renderizar sobre las culturas de expresión en un OD600 inicial de 0.3. Para inducir la sobreexpresión de proteínas, haga crecer la levadura en el medio de gatasa con temblor a 30 grados celsius durante el período de tiempo experimental adecuado.
A continuación, mida el OD600 de cada cultivo al final del período de inducción. Y estandarice todos los recuentos de celdas al valor OD600 más bajo. Cosecha los cultivos en tubos centrífugos de 50 mililitros por centrifugación y resuspend los pellets en un mililitro de agua estéril quieta por cada 10 mililitros de cultivo cultivado.
Aliquot un mililitro de resuspensión celular en tubos de microcentrífuga individuales para una centrifugación adicional y aspirar los sobrenadantes. A continuación, congelar los gránulos celulares en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para angarizar las células para el análisis de manchas occidentales, descongele los gránulos de células de levadura sobre hielo antes de la resuspensión en 100 microlitros de agua destilada.
Añadir 300 microlitros de hidróxido de sodio de 0,2 molares y 20 microlitros de 2-Mercaptoetanol a cada muestra de célula. Y resuspender los pellets por pipeteo. Después de una incubación de 10 minutos sobre hielo, pele el agua de las células por centrifugación y resuspender las muestras en 100 microlitros de tinte de carga.
A continuación, hierva las muestras durante 10 minutos en un bloque de calentamiento. Mientras las muestras están siendo suaves, coloque dos geles en un soporte de gel y llene la cámara interna hasta la parte superior con tampón de carrera y la cámara exterior a la marca de línea de dos geles. Cuando las muestras estén listas, cargue 15 microlitros cada uno, solución de lysis celular, en cada pocóptico del pozo 10, 12%gel de poliacrilamida y añadir cinco microlitros de escalera de proteínas al pozo de la escalera de proteínas.
Ejecute el gel durante aproximadamente 45 minutos a 150 voltios o hasta que el tinte de carga frontal llegue a la parte inferior del gel. Mientras el gel está funcionando, remoje dos almohadillas de fibra por gel en tampón de transferencia y un fluoruro de polivinilideno, o PVDF, membrana por gel en metanol. Cuando el gel esté listo, enjuague la membrana en el tampón de transferencia y coloque una almohadilla de fibra presoaked en la parte inferior de una célula del aparato de transferencia semi-seca.
Seguido por la membrana PVDF, el gel y la segunda almohadilla de fibra presoaked. A continuación, ajuste la potencia a 150 miliamperios durante una hora. Al final de la transferencia de proteínas, retire la membrana del aparato de transferencia para un breve enjuague con agua destilada.
Coloque la membrana enjuaada, el lado de la proteína hacia arriba en una pequeña caja de tinción y cubra la membrana con solución salina o TBS tamponada, bloqueando el tampón durante una hora de incubación a temperatura ambiente con un suave balanceo. Al final de la incubación de bloqueo, incubar la membrana durante la noche con una histona anti-levadura y un anticuerpo específico de modificación en TBS a cuatro grados centígrados. Y un anticuerpo de control de carga nuclear adecuado.
A la mañana siguiente, lavar la membrana cuatro veces en TBS, complementado con 0.1%polisorbato 20 durante cinco minutos con balanceo a temperatura ambiente por lavado. Después del último lavado, incubar la mancha con los anticuerpos secundarios apropiados durante una hora a temperatura ambiente. Seguido de cuatro lavados de cinco minutos en TBST y un lavado de cinco minutos en TBS solo con balanceo.
A continuación, imagine la mancha en un sistema fluorescente occidental de imaginación durante dos minutos. Aquí, la supresión del crecimiento en cultivos sólidos y líquidos se muestra con efectos significativos sobre el crecimiento de la levadura observados en presencia de ga gactosa infundida en modelos de sobreexpresión de sarcoma. Una disminución significativa en los niveles de histona son evidentes en el modelo de sobreexpresión de sarcoma fusionado y se observan aumentos significativos en los niveles de acetilación de histona en el modelo de sobreexpresión de la proteína de unión AL TAR 43, que no se observan ni en el modelo de sobreexpresión de sarcoma o alfa sinucleína.
También hay disminuciones significativas en los niveles de histona en el modelo de sobreexpresión de sinucleína alfa. En este experimento de afinación de sacarosa, menor es la cantidad de gatasa utilizada para inducir la fusionación en la sobreexpresión de sarcoma, la menor toxicidad que se observa tanto en el cultivo sólido como en el líquido. Es importante destacar que cuanto menor sea el nivel de la sobreexpresión del sarcoma, menor será la magnitud de la reducción de los niveles de histona.
Al realizar este protocolo, es imperativo estandarizar la cantidad de levadura en cada muestra para permitir una comparación adecuada en los niveles de modificación post-traduccional de la histona. 2-Mercaptoetanol debe utilizarse bajo una capucha para evitar la inhalación. Si se utiliza la mancha de Ponceau, debe desecharse correctamente.
