La détection des protéines ubiquitination

Résumé

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture In vivo et le test In vitro.

Résumé

L'ubiquitination, la fixation covalente de l'ubiquitine polypeptide de cibler les protéines, est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Ils comprennent l'enzyme activant l'ubiquitine-E1, E2 enzyme conjuguant l'ubiquitine et ubiquitine ligase E3. Contrairement à E1 et E2, E3 ubiquitine ligases la spécificité de substrat d'affichage. D'autre part, de nombreuses enzymes deubiquitylating ont des rôles dans le traitement des protéines polyubiquitinated. L'ubiquitination peut entraîner un changement de la stabilité des protéines, localisation cellulaire et l'activité biologique. Des mutations de gènes impliqués dans la voie d'ubiquitination / déubiquitination ou altération de la fonction système ubiquitine sont associés à différentes pathologies humaines telles que divers types de cancer, maladies neurodégénératives et les troubles métaboliques. La détection de l'ubiquitination altérée ou normale de protéines cibles peuvent fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture

Protocole

Détection de l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture

1. Transfecter des cellules en culture avec des plasmides exprimant la protéine d'intérêt et (épitope taggés version de) l'ubiquitine.
2. Faire complète du tampon de lyse cellulaire (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) avec orthovanadate de sodium 2 mM, 50 mM de fluorure de sodium, et les inhibiteurs de protéase.
3. Lyse des cellules avec tampon de 100 cellules lyse ul par plaque (6 vaisselle cm). Si un plus grand plat est utilisé, régler le volume en conséquence. Agiter le plat de soin de laisser le tampon de lyse couvrir toute la zone de cellules cultivées.
4. Recueillir les cellules avec un racleur de cellules et de transférer les lysats de cellules dans un tube eppendorf de 1,5 ml. Placer le tube sur une plaque chaude immédiatement à bouillir pendant 10 min.
5. Cisaillement des cellules avec un dispositif de sonication.
6. Ajouter 900ul de tampon de dilution (10 Triton mM Tris-HCI, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 1%). Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30-60 min avec rotation.
7. Faites tourner les échantillons dilués à 20.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant résultant d'un nouveau tube Eppendorf. Attention à ne pas perturber le culot.
8. Mesurer la concentration en protéines.
9. Préparer la protéine A ou G-agarose perles conjugué anticorps contre la protéine cible dans un tampon compatible (50% lisier). Coupez l'extrémité étroite d'une pointe P-200 pipette et transférer 14-20 ul de résine 500-1500 mg de lysats de cellules préparées pour immunoprécipitation. Pour les cellules avec une efficacité de transfection élevée, 500 ug sera suffisant. Pour les cellules avec une efficacité de transfection bas, plus de protéines peuvent être nécessaires.
10. Incuber le lysat cellulaire-billes mélange à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation.
11. Isoler les perles à 5000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Laver la résine avec le tampon de lavage (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) à deux reprises.
12. Faites tourner les perles pour une dernière fois à 20 000 xg pendant 30 sec. Aspirer le tampon de lavage résiduelle et faire bouillir la résine avec le tampon de chargement SDS 2X.
13. Charger les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse.
14. Détecter l'ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs. Pour immunoblot, nous avons généralement de détecter l'ubiquitine premier. La membrane sera alors utilisé pour détecter les protéines précipitées.

Détection de l'ubiquitination de protéines cibles par le biais d'ubiquitination in vitro dans le test

1. Faire tampon ubiquitination 5X (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 25 mM de MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM d'ATP). Rangez-les dans de petites aliquotes à -20 ° C pendant 6 mois. Certains protocoles aussi ajouter de la créatine phosphate et la créatine kinase dans le tampon pour régénération de l'ATP ^1,2.
2. Pour chaque réaction, préparer un mélange contenant les éléments suivants:
   

   8 pl	Buffer 5X ubiquitination
   250 ng	ubiquitination E1
   500 ng	ubiquitination E2
   0,5 pg	ubiquitine
   0,5 pg	protéine d'intérêt
   	l'eau à 40 ul volume total

   Comme témoins, de préparer des réactions similaires en l'absence de soit E1, E2, ou ubiquitine.
3. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure ou plus.
4. Arrêter la réaction par addition de tampon échantillon SDS-PAGE et faire bouillir l'échantillon pendant 10 min.
5. Charger les échantillons sur gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse.
6. Détecter l'ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs.

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Discussion

Dans cette présentation, nous avons d'abord décrit les étapes qui permettent de détecter la modification d'ubiquitine sur une protéine d'intérêt dans des cultures de cellules de mammifères. Afin de détecter spécifiquement sur ​​l'ubiquitination de la protéine d'intérêt, non pas sur les protéines qui interagissent de façon non covalente, nous avons utilisé une condition stricte pour la lyse cellulaire, immunoprécipitation et de lavage ^1,3. L'ubiquitination, détect?...

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