Fabrication et fonctionnement d'un insert d'oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Résumé

Fabrication et validation d'une plate-forme de add-on qui offre un meilleur contrôle sur l'oxygénation spatiale et temporelle dans une plaque à 6 puits. Le dispositif est adaptable à un certain nombre de systèmes de culture et peut être utilisé pour étudier les effets de l'oxygène sur la cicatrisation des plaies.

Résumé

L'oxygène est un modulateur clé de nombreuses voies de signalisation cellulaire, mais les dispositifs actuels permettant

Protocole

1. Fonctionnement de l'appareil

1. Le dispositif d'insertion hypoxiques contient 6 piliers qui nichent dans une norme de 6 puits assiette. Flux de gaz dans le pilier, à travers un réseau microfluidique à la base du pilier, et reflue hors de l'appareil. A la base du pilier formant la paroi du fond du microcanal est un 100 um d'épaisseur perméable aux gaz membrane de PDMS qui permet la diffusion d'oxygène entre le gaz microcanaux et des médias de la culture. Ainsi, le dispositif fonctionne en créant un gradient de concentration qui anime la concentration en oxygène des médias vers une valeur souhaitée.
2. L'appareil offre un certain nombre d'avantages sur la chambre hypoxique et d'autres systèmes d'oxygénation cellulaire: 1) minimise le chemin diffusion de l'oxygène permettant un contrôle plus rapide temporelle, 2) améliore le contrôle spatial de plus d'oxygénation, comme dépendant de la conception des piliers de microcanaux, 3) possède une plus petite empreinte de laboratoire et un débit plus élevé pour augmenter l'efficacité expérimentale, et 4) s'adapte à des outils communs de culture cellulaire (par exemple la plaque multipuits) sans l'exigence de connaissances et d'équipements spécialisés.

2. Fabrication de dispositifs

1. D'abord le tableau pilier est moulé avec PDMS réplique dans un moule préalablement usinées Delran.
2. Suivant le gaz microcanaux au bas de chaque pilier est fabriqué en utilisant la norme SU-8 photolithographie et de moulage de PDMS réplique.
3. Le gaz membrane perméable est fabriqué en faisant tourner défini de PDMS sur un wafer de silicium pour obtenir l'épaisseur désirée. Dans cet exemple nous utilisons une membrane 100 um d'épaisseur qui a été fabriquée en faisant tourner 500 rpm pendant 10 secondes, puis 900 rpm pendant 30 secondes.
4. Tous les composants sont collés ensemble après le traitement par plasma d'oxygène avec un appareil de poche de plasma (modèle BD-20, Produits Electro-Technic).

3. Configuration des périphériques

1. Insérez doucement appareil dans la plaque, en veillant à éviter les bulles. Pêche du périphérique lors de l'insertion aide à expulser les bulles d'un côté. Pour réelles basées sur les cellules expériences, cette étape doit être fait à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire stérile. Les chances de contamination sont considérablement réduits une fois que le dispositif est inséré, de sorte que le montage peut être reporté sur l'incubateur dans un environnement non stérile.
2. Relier les tubes du réservoir de gaz source pour les ports d'entrée et de sortie du dispositif. À base de cellules expériences, l'incubateur de culture doit avoir un trou pour permettre l'entrée des tubes et les tuyaux doivent être connectés après la réalisation de l'appareil et de le placer dans l'incubateur. Soyez prudent pour éviter de mettre une pression excessive sur l'appareil, ce qui pourrait déformer le PDMS suffisante pour écraser les cellules sous-jacentes.
3. Assurez-vous que le régulateur de débit de précision est fermé avant d'ouvrir le régulateur débardeur pour éviter tout débordement de l'appareil. Démarrer le flux de gaz. Régulateur de débit doucement ouverte de précision pour le débit souhaité (50-100 mL / min). Regardez la valeur de près au cours de la prochaine heure et faire les ajustements nécessaires, depuis la chute de pression va changer tout le système s'équilibre, en modifiant le débit. Pour éviter la formation de bulles dans les médias, de réduire le débit d'entre 10-20 ml / min après une durée d'équilibration initiale de 15 minutes avec le débit plus élevé.
4. Après une durée expérimentale voulue, arrêter le débit de gaz, enlever la plaque, et les cellules traiter en conséquence (par exemple, Lyse, teinture, compter, etc.)

4. Validation de périphérique

1. Calibration
   1. Sélectionnez le nombre et l'emplacement des postes de l'oxygène fluorescentes
      Faire glisser le capteur (Foxy) (selon les exigences de validation) qui sera utilisé pour la mesure de l'oxygène. La diapositive contient un revêtement ruthénium colorant fluorescent qui est trempé par l'oxygène.
   2. Exposer glisser directement à 0, 10 et 21% d'oxygène du réservoir de gaz et de capturer des images après 5 minutes pour atteindre l'équilibre approprié.
   3. Exporter l'intensité de l'image moyenne pour chaque position et la concentration d'oxygénation parcelle dépend de l'intensité fluorescente.
   4. Générer courbe d'étalonnage en ajustant les courbes linéaires à la ligne de 0-10% et 10-21% en ligne.
2. Hétérogénéité
   1. Établir des points multiples couvrant la largeur de la voie à un intervalle défini (par exemple tous les 1 mm). Notez qu'il peut y avoir un chevauchement d'images en fonction de l'espacement.
   2. Mesurer la concentration d'oxygène à la surface du puits à travers le dispositif
3. Equilibration
   1. Choisir trois points sur la diapositive dans laquelle FOXY pour mesurer la concentration d'oxygène.
   2. Immédiatement après la capture d'une première image à des niveaux d'oxygène ambiant, ouvrez le régulateur de débit de précision pour commencer écoulement du gaz dans le dispositif. Capture d'images à un intervalle approprié pour évaluer la durée et l'étendue de l'oxygène concentréquilibration tion (par exemple toutes les 10 secondes pendant 30 min.)

5. Applications

1. Cicatrisation
   1. Un jour avant l'expérience, faire tremper l'insert stérilisés PDMS dans un milieu sans sérum pour réduire les inhiber la formation de bulles de gaz dans le puits.
   2. Cellules en culture à 100% de confluence dans une plaque à 6 puits.
   3. Créer rayures droites dans les monocouches avec une pointe de pipette P200 pour simuler des blessures.
   4. Aspirer le milieu cellulaire, rincez avec les médias de 5 ml, et aspirer à nouveau. Il est important de ne pas perturber la monocouche de cellules.
   5. Remplir le puits avec 4 ml milieu sans sérum pour réduire la prolifération cellulaire.
   6. Placez l'insérer dans le puits et relier chaque puits à une concentration d'oxygène correspondant.
   7. Placer la plaque de 6 puits avec insert sur scène chauffée à 37 ° C.
   8. Capture d'images laps de temps des cellules à l'intervalle désiré et la durée totale. T_Scratch MATLAB, un algorithme de mesure des plaies, peut être utilisé pour analyser la surface cicatrisée.

6. Les résultats représentatifs

1. Dispositif de validation
   Le dispositif d'insertion hypoxiques expositions de grandes améliorations sur la chambre hypoxique en termes de temps d'équilibrage de l'oxygène et l'étendue, nécessitant moins de 2 minutes pour se stabiliser à l'oxygène de 0,5%. La membrane ainsi dispositif de taille de l'espace en bas a été le facteur déterminant de l'efficacité d'équilibration, avec des tailles plus grandes lacunes nécessitant plus de temps pour atteindre l'état stationnaire des valeurs de concentration en oxygène. Le dispositif permet également beaucoup de contrôle sur l'oxygénation spatiale dans un seul puits, permettant la formation de plusieurs conditions, et même générer un profil d'oxygène cycliques à travers la surface du puits.
2. Cicatrisation des plaies
   Monocouches de cellules ont été exposées à 10% ou 21% d'oxygène et la surface de la plaie a été analysé au cours du temps. Scratches exposés à l'oxygène 21% fermés le plus lent et 10% plus rapide. La figure 1 montre des images d'une égratignure au cours des 17 heures. Les graphiques de la figure 5 montrent le pour cent de surface de la plaie ouverte pour les deux concentrations d'oxygène pour la durée de l'expérience.

Figure 1. Schéma et diagrammes illustrant les fonctions du périphérique. Le dispositif d'insertion d'oxygène est fabriqué par photolithographie classique (réseau microfluidique), le moulage réplique (microfluidique réseau et insérez échafaudage), et défini filature de PDMS (perméables aux gaz par membrane). A) Le dispositif de l'oxygène imbriquées dans une plaque à 6 puits. B) Exemples de 24 et de 96 puits tableaux pilier. C) Une coupe transversale schématique d'un pilier. L'oxygène se jette dans l'appareil grâce à l'entrée et se déplace à travers un réseau microfluidique au bas de la colonne. L'oxygène peut diffuser librement à travers la membrane perméable aux gaz PDMS au bas de la colonne et se dissolvent dans les milieux de culture. D) Une image au microscope montrant les différentes fonctionnalités d'un pilier à canal unique d'en haut, avec des messages de verre collé pour les études d'équilibration.

Figure 2. Validation de l'appareil avec des capteurs d'oxygène. Tension d'oxygène au sein de chaque puits a été caractérisée en utilisant un capteur d'oxygène planaires ruthénium. Tous les mélanges d'azote oxygène contenu équilibré et 5% de CO ₂ pour mise en mémoire tampon des médias. A) Terrain illustrant l'effet de la hauteur de la poste, et la distance de diffusion ainsi l'oxygène entre la membrane et des cellules, sur le temps d'équilibrage et d'efficacité. Heights ont été établis par verre taillé messages liés au fond de l'appareil. Tous les trois tailles après des temps d'équilibrage rendement beaucoup améliorée au cours de la chambre hypoxique. Notez que le temps est sur une échelle logarithmique. B) Terrain dépeignant le temps d'équilibration rapide de l'oxygène de réponse du dispositif de 0,2 mm écart. C) multi-positions linescans ont également été prises à travers le bien sous le microcanal pour assurer l'homogénéité de la concentration d'oxygène introduite par le dispositif. Graphique représente la concentration d'oxygène mesurée après infusion de 0%, 10% et 21% d'oxygène pendant 10 min. D) Dispositif maintient efficacement l'oxygène de 10% sur 5 jours.

Figure 3. Expérimentation avec des dessins plus complexes d'oxygène microcanal. A) configuration double-condition à microcanaux rendements stables 0% et le profil de 21% d'oxygène de plus de 14 jours. B) Un motif interdigitées et sinueuses de 500 um de largeur microcanaux s'étendant à travers erésultats du pilier e dans un profil d'oxygène cycliques. Notez que les données représente un seul essai représentatif que l'alignement a été difficile à microcanaux.

Figure 4. Timelapse images de 0 fermeture de la plaie, 7 et 17 heures après zéro initial. Les cellules ont été livrées en oxygène de 21% pendant toute la durée de l'expérience.

Figure 5. Effet de la concentration en oxygène sur le taux de cicatrisation dans un essai de zéro.

Discussion

L'appareil est fabriqué par la norme SU-8 photolithographie, moulage par réplique, et a défini la filature et fait entièrement de polydiméthylsiloxane. Le gaz est introduit dans le dispositif pour établir un gradient de concentration entre le pilier microcanaux et les milieux de culture, la conduite du système vers un équilibre de la concentration d'oxygène désirée. Le dispositif a montré sa capacité à moduler l'oxygénation temporelles et spatiales à l'intérieur d'un puits, ainsi que de moduler le comportement cellulaire appropriée. La structuration spatiale de l'oxygénation est défini par le microcanal à la base du pilier, donc une variété de modèles pourraient être mis en œuvre dans l'élaboration du photomasque. De plus, la perfusion du gaz désiré dans la phase gazeuse du puits est prévu pour améliorer le temps d'équilibration et l'étendue de l'hypoxie. Un réseau microfluidique mélange pourrait être adapté à l'appareil pour fournir un moyen de produire des mélanges de gaz roman de seulement quelques réservoirs de gaz de stock. Enfin, un mécanisme d'échange de médias qui éliminerait la nécessité pour l'enlèvement de l'appareil de la plaque multipuits, dont les cellules peuvent réagir.

L'appareil a des applications dans toute expérimentation in vitro ou ex vivo nécessitant un contrôle plus la concentration en oxygène. Comme l'oxygène est une variable importante physiologiques affectant une grande majorité des voies de signalisation, les domaines de recherche qui pourraient profiter est limitée par la créativité du chercheur. Certains champs qui pourraient bénéficier d'un meilleur contrôle de la concentration en oxygène temporelle de comprendre les métastases du cancer, l'apnée du sommeil, et les lésions de reperfusion cardiaques ischémie, parmi beaucoup d'autres. Par exemple, l'hypoxie intermittente a été corrélée avec des cancers plus envahissantes, upregulating un certain nombre de gènes associés à metastastis par rapport à l'hypoxie continue et normoxie. Contrôle spatial est également important, comme les gradients d'oxygène sont essentielles dans le développement, la zonation du foie, la toxicité des médicaments, et la niche de cellules souches. Le dispositif présenté dans cet article va bénéficier d'un certain nombre de domaines de recherche en fournissant un système avec une plus petite empreinte de laboratoire, relativement simples exigences opérationnelles et de contrôle beaucoup plus grand sur l'exposition d'oxygène aux cellules.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513