Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l&#39;adulte Caenorhabditis elegans</em

Résumé

Stable profilage isotopique par analyse spectrométrique de masse chromatographie en phase gazeuse du flux métabolique intermédiaire est décrite dans le nématode, Caenorhabditis elegans. Les méthodes sont détaillées pour évaluer l'enrichissement isotopique en dioxyde de carbone, des acides organiques, acides aminés après une exposition pendant le développement d'isotopes soit sur gélose ou durant l'âge adulte dans la culture liquide.

Résumé

Stable profilage isotopique a longtemps permis d'enquêtes sensibles sur les conséquences métaboliques de mutations génétiques et / ou thérapies pharmacologiques dans des modèles cellulaires et de mammifères. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour effectuer stables profilage isotopique du métabolisme intermédiaire et flux métaboliques dans le nématode Caenorhabditis elegans. Les méthodes sont décrites pour le profilage de l'ensemble vis des acides aminés libres, le dioxyde de carbone marqué, étiqueté acides organiques et des acides aminés marqués chez les animaux exposés à des isotopes stables soit de développement précoce de croissance sur des plaques d'agar nématodes ou le début que les jeunes adultes tandis exposée à divers traitements pharmacologiques en culture liquide. Acides aminés libres sont quantifiés par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en aliquots ver toute extraction dans l'acide perchlorique à 4%. Universellement étiqueté ¹³ C-glucose ou 1,6 - ¹³ C _2-glucose est utilisé comme le précurseur des isotopes stables de carbone dont l'étiquette est tracée par spectrométrie de masse de dioxyde de carbone (à la fois l'atmosphère et dissous) ainsi que des métabolites indicatif de flux à travers la glycolyse , le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer les effets du temps d'exposition d'isotopes, divers protocoles de compensation bactériennes, et les méthodes alternatives perturbations ver de type sauvage nématodes, ainsi que l'ampleur relative de l'incorporation isotopique dans mitochondriale vers le complexe III mutant (ISP-1 (qm150) ) par rapport au type sauvage vers. Application de profilage isotopique stable en présence de nématodes vivants offre une capacité nouvelle pour examiner l'ensemble des altérations au niveau du métabolisme des animaux en temps réel qui sont causées par des troubles individuels génétiques et / ou thérapies pharmacologiques.

Protocole

Un protocole: Stable profilage isotopique du métabolisme intermédiaire au cours C. le développement elegans sur des plaques NGM.

* Remarque: l'enrichissement des isotopes stables peut être mesurée en succès jeunes populations de nématodes adultes après l'exposition isotope (avec soit universellement marqué ¹³ C ou du glucose 1,6 - ¹³ C _2-glucose) commence soit au début du développement ou dans l'âge adulte. Ce protocole facilite le suivi simultané de la santé animale, le développement et la croissance sur la norme de croissance des nématodes médias (NGM) plaques, ce qui n'est pas aussi facile à réaliser dans la culture liquide.

1. Préparer 100 mm boîte de Pétri avec 10 ml de milieu de croissance des nématodes (NGM), par la technique standard. ¹
2. Plaques NGM Étendre OP50 E. coli ¹ et laisser sécher pendant la nuit.
3. Ajouter 500 ul de 200 mM 1,6 - ¹³ C ₂ du glucose (pour atteindre une concentration finale de 10 mM sur une plaque NGM) uniformément sur ​​la plaque. Laisser sécher une nuit.
4. Bleach gravides vers adultes ^1. Plaque récupéré les oeufs sur des plaques NGM, sans bactéries ou 1,6 - ¹³ C ₂ du glucose. Incuber à 20 ° C la nuit.
5. Le lendemain, le transfert éclos, les larves L1-arrêtés sur des plaques NGM auparavant réparties avec le 1,6 - ¹³ C _2-glucose et OP50 E. coli (par l'étape 2, ci-dessus). Cultivez les vers de mettre en scène des jeunes adultes (48-72 heures, selon la variété), vers les soins prenant pas mourir de faim.
6. Recueillir synchrones, premier jour des vers adultes jeunes de plaques avec 3-4 ml d'basale S..
7. Lavez les vers dans 50 mL de S. basal dans 50 ml tubes Falcon. Autoriser les vers à granulés par gravité pendant 5 minutes. Retirer le surnageant à ~ 5 ml. Répétez laver deux fois plus.
8. Estimer le nombre ver en comptant trois aliquotes 100 ^2. Ajuster la concentration ver à 1000 vers / mL de S. basale.
9. Pipeter 1 ml (1000 vers) dans un tube de 1,5 ml en plastique centrifugeuse.
10. Ajouter 69 uL de 60% PCA contenant l'étalon interne (ε-aminocaproïque) à une concentration finale de 4% PCA et 200 pmol de standard interne.
11. Laissez-les vers se déposent par gravité x 5 minutes. Retirez et conservez le surnageant dans un autre tube.
12. Broyer les échantillons ver utilisant le plastique homogénéisateur (Kontes Pellet pilon) et motorisé de forage (Kontes Pellet pilon Moteur sans fil) pendant 15 secondes. Confirmer visuellement perturbations ver par microscopie optique. Répéter si nécessaire.
13. Transférer le surnageant de l'étape n ° 11 à combiner avec un homogénat de l'étape # 12.
14. Centrifuger l'échantillon à 2250 rpm (1300 xg) pendant 5 minutes.
15. Transférer le surnageant frais 7 ml tube de verre. Enregistrer granulés pour le dosage de la concentration de protéines, tel que détaillé à l'étape n ° 20, ci-dessous.
16. échantillons de pH à 7-8 (neutre) plage à l'aide de KOH 4N.
17. Centrifuger les échantillons neutralisés dans 7 ml tube de verre à 2250 rpm (1300 xg) pendant 5 minutes pour éliminer les sels.
18. Transférer le surnageant frais 7 ml tube de verre.
19. Préparer des échantillons neutralisés pour la quantification métabolite par:
    1. Chromatographie liquide haute performance (CLHP): Séparez 50 uL d'échantillon neutralisé par injection directe dans HPLC. Libre de quantification d'acides aminés est réalisée par CLHP (Varian) en utilisant la dérivatisation pré-colonne avec détection o-phtalique et fluorescentes, comme décrit précédemment ^3-4.
    2. Chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (GC / MS): Procéder à l'extraction des échantillons restants neutralisé à l'aide résine échangeuse d'ions (Bio-Rad) pour GC / MS détermination de l'enrichissement isotopique en acides aminés et des acides organiques, comme détaillé dans PROTOCOLE D.
20. Ajouter 1 mL de NaOH 1N à la protéine de culot restant (de l'étape # 15) dans 7 ml tube de verre.
21. Incuber NaOH traités échantillon de protéine à la température ambiante tout en tournant (Labnet * LabRoller Rotator) pendant la nuit jusqu'à dissolution.
22. Utilisez 75-100 uL de NaOH traités protéines afin de déterminer la concentration de protéines par des méthodes standards (DC Protein Assay, Bio-Rad).

Protocole B. profilage des isotopes stables du métabolisme intermédiaire en C. adultes jeunes elegans en culture liquide.

* NOTE: Les effets pharmacologiques sur le flux métabolique intermédiaire dans les nématodes adultes peut être étudiée après l'exposition de isotopique sur le premier jour de la ponte, soit sur des plaques NGM (voir le Protocole A, ci-dessus) ou en culture liquide. Nous préférons cette dernière approche pour maximiser la rentabilité des isotopes stables et l'utilisation des agents pharmacologiques.

1. Diluer synchrone, premier jour de ponte de jeunes adultes dans basale S. contenant du cholestérol 0,0005% (obtenue en ajoutant 0,5 mL de 1% de cholestérol (dissous dans l'éthanol à 95%) pour 1L d'basale S.) à 2000 animaux par 500 ul.
2. Mettre en place la culture ~ 4 ml de volume total (s) dans 25 ml Erlenmeyer, comme suit:

   TRAITEMENT:	NONE	«Drogue A"
   Basal S. avec le cholestérol	3020 uL	3020 UL - "Drug un" volume
   Isotopes stables (1,6 - 13 C 2-glucose)	80 ul	80 ul
   K12 E. coli (DO 660 2,5 à 3)	400 ul	400 ul
   Worms Jeune adulte (2000)	500 ul	500 ul
   Un médicament (concentration souhaitée)	-	Comme souhaité

3. Couvrir avec une feuille flacons. Agiter flacons pendant 24 heures à 220 rpm à 20 ° C incubés plateforme shaker.
4. Assurez-vous que des flacons ne sont pas totalement étanche, comme l'oxygène est nécessaire pour le flux métaboliques intermédiaires et pour l'étiquetage des métabolites résultant de nématodes endogène.
5. Lavez les vers en ajoutant 4 ml de volume de culture à 46 mL de S. basale dans un tube de 50 ml en plastique conique. Autoriser les vers à granulés par gravité pendant 5 minutes. Aspiration surnageant jusqu'à ~ 5 mL reste. Répétez lavage en tube de remplissage deux fois plus à 50 mL avec S. basale.
6. Concentré vers lavé pour 1000 vers / mL dans un tube de 1,5 ml en plastique centrifugeuse.
7. Ajouter 69 ul d'acide perchlorique à 60% (PCA) et 2 ul de 10 uM standard interne (ε-aminocaproïque) pour atteindre une concentration finale de 200 pmol standard interne et de 4% PCA.
8. Préparer les échantillons comme des étapes par # 11-22 dans le protocole A.

PROTOCOLE C-1. Contrôle de l'utilisation isotopiques dans les vers adultes sur des plaques en traçant de carbone marqué dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dissous.

* NOTE: Alors que les protocoles A et B en détail les méthodes pour contrôler l'incorporation d'isotopes en métabolites libres dans les vers plus de 2-3 jours de développement ou un jour de la vie adulte, respectivement, la confirmation brut de la réussite et la cinétique d'incorporation isotopique sur un parcours court laps de temps (c'est à dire, à quelques minutes à quelques heures) peut être réalisé par le label de surveillance du dioxyde de carbone atmosphérique (CO ₂₎ a publié des vers ou contenues dans le dioxyde de carbone dissous dans l'extrait ver. Des bactéries vivantes ou tuées peuvent être alimentés à des vers lorsqu'il est cultivé sur des plaques (PROTOCOLE C-1). Les bactéries n'est pas nécessaire pour l'exposition des isotopes de courte durée des vers en culture liquide (PROTOCOLE C-2).

1. Préparer 100 mm boîte de Pétri avec 10 ml de gélose NGM. Fais plaques NGM avec soit en direct ou UV-tué OP50 E. coli (comme le montre la figure 1). Laisser les plaques sécher jusqu'au lendemain.
2. Ajouter 500 ul de 200 mM 1,6-étiquetées ^C-13 _2-glucose pour OP50 plaques NGM diffusion (pour la concentration d'isotopes finale de 10 mM sur une plaque NGM). Laisser les plaques sécher jusqu'au lendemain.
3. Obtenir synchrone, premier jour de ponte, vers les jeunes adultes cultivés sur gélose NGM propager uniquement avec OP50 E. coli.
4. Transfert 1000 vers les jeunes adultes à l'expérimental gélose NGM contenant des isotopes stables et E. coli (préparé comme pas par # 1-2, ci-dessus).
5. Plaque NGM place expérimentale (sans couvercle) dans la chambre de verre sur mesure équipé bien étanche robinet 3 voies pour permettre l'échantillonnage précis et l'atmosphère de remplacement. Fermer immédiatement les chambres avec un disque de verre optiquement transparents. Couverture de couture où le verre se trouve le disque sur la plaque avec de la graisse sous vide poussé pour sceller. Un temps record comme "0 heure".
6. Échantillon de 10 ml de l'atmosphère de la chambre de verre par robinet 3 voies avec une seringue de 20 ml à 30 minutes, 60, 90 et 120. Transférer chaque échantillon dans l'atmosphère à un pré-préparé 10 ml bouchon de caoutchouc surmonté tube de verre contenant 1 mL de 1 mm ₃ NaHCO dans NaOH 0,1 N qui a été scellée sous vide.
7. Injecter 10 ml de retour d'air dans chaque chambre de verre à travers robinet 3 voies en utilisant une seringue de 20 ml. Fermer le robinet à la chambre après l'échantillonnage / réinjecter atmosphère et avant la reprise d'incubation entre les points de collecte en temps.
8. Injecter 100 ml d'acide phosphorique à 20% à travers le bouchon en 10 ml bouchon de caoutchouc surmonté tube de verre contenant du CO ₂ atmosphérique échantillon.
9. Retirer les 2 mL de l'atmosphère et l'injecter dans 12 ml bleu-dessus échantillonneur automatique des tubes pré-rempli avec de l'hélium pour la mesure du CO ₂ atmosphérique.
10. Analyser "de CO ₂ atmosphérique échantillons" par Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Chambres de verre ouverte après deux heures d'incubation d'isotopes et de la collecte de tous les échantillons atmosphériques.
12. Lavez les vers hors de plaques NGM dans 3 mL de S. basale.
13. Lavez les vers dans 50 ml S. basale dans 50 ml tubes Falcon. Répétez laver deux fois plus.
14. Concentré de vers à ~ 1000 vers / ml dans le tube 7 ml en verre à fond rond (s).
15. Tube de verre sous vide avec bouchon en caoutchouc d'étanchéité.
16. Ajouter 100 uLd'acide phosphorique à 20% grâce à un bouchon en caoutchouc avec une seringue pour libérer CO ₂ dissous.
17. Retirer les 2 mL de l'atmosphère et les injecter dans 12 ml bleu-dessus échantillonneur automatique des tubes pré-rempli avec de l'hélium pour mesure du CO ₂ dissous.
18. Analyser "CO ₂ dissous échantillons» par spectromètre de masse gaz-ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Alternative Protocole (C-2): l'utilisation de surveillance isotopiques dans les vers adultes en culture liquide en traçant de carbone marqué dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dissous.

1. Obtenir synchrone, premier jour de ponte, vers les jeunes adultes cultivés sur gélose NGM répandit avec OP50 E. coli.
2. Lavez les vers dans 50 mL de S. basale dans 50 ml tubes Falcon. Autoriser les vers à granulés par gravité pendant 5 minutes. Retirer le surnageant à ~ 5 ml. Répéter deux fois plus de lave.
3. Transfert 1000 vers les jeunes adultes dans 1 ml de S. basale à 10 ml tube de verre à fond rond. Ajouter 10,1 pi de 1 M de stocks universellement marqué ¹³ C-glucose à 1 ml de vers de terre pour atteindre la concentration finale de 10 mM.
4. Oxygéner le tube de verre à fond rond contenant des vers et des isotopes en échangeant avec l'atmosphère qui coule 100% d'oxygène dans le tube ouvert pendant 2 minutes. Fermez immédiatement le tube avec un bouchon en caoutchouc.
5. Agiter les tubes expérimentaux à 20 ° C incubés agitateur plate-forme à 220 tpm. Enregistrement à partir du temps comme "0 heure".
6. Échantillon de 5 ml de l'atmosphère à partir de 10 ml tube de verre à fond rond en utilisant une seringue de 10 ml et une aiguille de calibre 25 à travers le bouchon en caoutchouc à 30 minutes, 60, 90 et 120.
7. Transférer chaque échantillon dans l'atmosphère à un bouchon de caoutchouc pré-préparés, a dépassé les 10 ml tube de verre contenant 1 mL de 1 mM NaHCO ₃ dans NaOH 0,1 N qui a été scellée sous vide.
8. Injecter 5 ml de retour d'air dans chaque tube de verre à fond rond expérimental contenant des vers et des isotopes à travers le bouchon de caoutchouc en utilisant une seringue de 10 ml et une aiguille de calibre 25.
9. Reprise d'incubation de 10 mL tubes expérimentaux en verre à fond rond contenant des vers et des isotopes par agitation à 220 rpm entre les points de collecte en temps.
10. Injecter 100 ml d'acide phosphorique à 20% à travers le bouchon dans l'atmosphère contenant bouchon de caoutchouc a dépassé les 10 ml tube de verre.
11. Retirer les 2 mL de l'atmosphère et les injecter dans 12 ml bleu-dessus échantillonneur automatique des tubes pré-rempli avec de l'hélium pour la mesure du CO ₂ atmosphérique.
12. Analyser "de CO ₂ atmosphérique échantillons" par Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. À la fin de la période expérimentale, se laver les vers dans 50 ml S. basale dans 50 ml tube Falcon. Laisser un ver granulés pour former par la gravité. Aspiration surnageant jusqu'à ~ 5 mL reste. Répétez lave par deux fois plus dans 50 mL de S. basale.
14. Concentré de vers à ~ 1000 vers / mL dans 7 ml tube de verre à fond rond. Ajouter un bouchon en caoutchouc et le tube d'étanchéité sous vide. Ajouter 100 ul d'acide phosphorique à 20% en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 25 à travers le bouchon en caoutchouc pour libérer le ver de CO ₂ dissous.
15. Retirer les 2 ml atmosphère et les injecter dans 12 ml bleu-dessus échantillonneur automatique des tubes pré-rempli avec de l'hélium pour mesure du CO ₂ dissous.
16. Analyser "CO ₂ dissous échantillons» par spectromètre de masse gaz-ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protocole D. Traitement neutralisé échantillons provenant de protocoles A et B pour les acides aminés et l'analyse des acides organiques par chromatographie gazeuse / spectrométrie de masse.

1. Préparation de billes:
   1. Ajouter 1 N HCl à la fois à une Ag et Ag 50 perles séparément dans des béchers 1L.
   2. Agiter chaque ballon pendant 30 minutes avec un agitateur magnétique.
   3. Lavez perles à l'eau déminéralisée jusqu'à pH 10 fois de lavages sont égaux à un pH de l'eau.
2. Préparation de la colonne:
   1. Insérer un tampon de coton juste au-dessus de la partie la plus étroite de la pipette Pasteur pointe.
   2. Ajouter perles chargé de chacune des deux colonnes par échantillon, en remplissant chacun pour environ un tiers de la hauteur de la colonne. Utilisez AG1 perles pour l'extraction des acides organiques. Utilisez AG50 perles pour l'extraction des acides aminés.
3. Traitement des échantillons:
   1. Ajouter 500 ul d'échantillon à la colonne avec des perles AG1 facturés. Rien n'est ajouté à l'échantillon (voir le protocole A, étape # 19B) avant de s'adresser à AG1 colonne pour extraire les acides organiques, si l'échantillon est déjà à pH neutre.
   2. Ajouter 1 mL de HCl 0,1 N à l'échantillon restant avant de l'appliquer à la colonne AG50 pour extraire les acides aminés.
   3. Laisser les échantillons afin de fonctionner complètement à travers les colonnes.
   4. Laver la colonne avec de l'eau 10 fois jusqu'à ce que les lavages sont neutres (7-8 gamme de pH).
   5. Eluer colonnes aux produits frais, étiquetés de verre de 4 flacons ml:
      1. Pour l'extraction d'acides organiques, ajouter 3ml de 3 N HCl à AG1 colonne. Ceci permet d'analyser l'enrichissement isotopique en nombre total de carbones étiquetés parmi les trois espèces de carbone (lactate), 4-carbone espèces (aspartate, le succinate, malate),À 5 carbones espèces (glutamate), et 6 espèces de carbone (citrate).
      2. Pour l'extraction des acides aminés: ajouter 3ml de 4 N NH ₄ OH à AG50 colonne. Ceci permet d'analyser l'enrichissement isotopique en nombre total de carbones étiquetés parmi les trois espèces de carbone (alanine) et 5 de carbone-espèces (glutamine).
   6. Placer les flacons dans Reacti-Vap III évaporateur nuit jusqu'à sec.

E. Exemple de dérivatisation et paramètres machine pour la spectrométrie de masse

Ajouter 50 uL d'acétonitrile et 50 ul de N-méthyl-nt-butyldiméthylsilyle trifluoroacétamide (MTBSTFA) à chaque flacon d'échantillon. Couvrir, mélanger et laisser incuber pendant 30 minutes à 60 ° C. Injecter 1 à 2 l par échantillon en chromatographie en phase gazeuse / spectromètre de masse (GC / MS).

F. Analyse des résultats

1. Quantification des pics d'acide aminé. La quantification de chaque acide aminé par analyse HPLC est calculée en utilisant l'aire de chaque pic relativement à celle de l'étalon interne.
2. Calcul d'enrichissement isotopique. Stable enrichissement isotopique est calculé dans Excel (Microsoft) pour chaque espèce en fonction de la formule suivante: Excédent Pourcentage Atom, corrigé (APE) = (R _{SA-R er)} * 100 / [(R _{SA-R er)} 100], où R _SA - Ratio de l'échantillon et _St R - Ratio de la norme.
3. Évaluer les différences statistiques entre l'enrichissement de l'échantillon. T de Student-test est utilisé pour évaluer l'importance de l'acide aminé par rapport et les différences entre les échantillons marqueur isotopique.

Les résultats représentatifs:

Isotopes stables est bien intégrée dans les vers adultes jeunes, comme en témoignent de carbone marqué mesurée en CO ₂ atmosphérique et de CO 2 dissous ver. Dans les vers nourris soit vivant ou UV-irradiés tué OP50 E. coli, le ratio de ¹³ CO ₂ à ¹² CO ₂ a été plus grande dans le CO ₂ dissous vers fraction relative aux émissions de CO ₂ atmosphérique libérés (Figure 1). Nourrir les vers vivants ou tués OP50 E. coli n'a pas modifié significativement la valeur mesurée ¹³ CO ₂ à ¹² CO ₂ dans l'extrait de ver ratio de lavage (voir protocole C1).

Une exposition prolongée à des isotopes stables de la période larvaire précoce augmenté enrichissement isotopique en métabolites intermédiaires. Corrigé excès Pourcentage des atomes de carbone étiquetés déterminée métabolites intermédiaires des jeunes adultes vers de type sauvage a été plus grande dans toutes les espèces de glutamate lorsque les vers ont été nourris universellement marqué ¹³ C-glucose et bactéries vivent au long du développement par rapport aux animaux traités de façon similaire nourris bactéries étiquetés pour 48 heures seulement après avoir atteint la ponte au stade adulte (figure 2).

Effet de la compensation fois sur l'enrichissement isotopique. Indépendamment de l'exposition timecourse, tous les animaux ont été cultivées sur des plaques «approuvé» du marqueur isotopique avant la préparation en aval pour GC / MS analyses. Comparaison des protocoles de compensation a été réalisée comme le montre la figure 2, y compris l'alimentation des vers pendant 2 heures sur gélose NGM répandit avec bactéries vivantes fraîches sans isotopes ou d'alimentation sur gélose NGM sans bactéries pendant 2 heures, et de l'alimentation sur gélose NGM sans bactéries pour 2 ou 6 heures. Indépendamment du cours d'exposition isotopiques, aucune différence significative dans l'enrichissement isotopique en métabolites intermédiaires de la jeune extraire ver adulte entière a été observée lorsque les animaux ont été défrichées sur des plaques sans bactéries pour 2 ou 6 heures. En revanche, l'enrichissement isotopique moins a été observée dans métabolites intermédiaires lorsque les animaux ont ensuite été «effacé» de l'isotope en excès en se nourrissant de bactéries non marqué pour deux heures. Toutefois, l'augmentation de l'enrichissement en 3, 4 et 5 espèces était évident lorsque les vers ont été exposés à des isotopes du début de la période larvaire. Par conséquent, le protocole de compensation optimale a été déterminé à la compensation des vers suite à leur incubation sur les plaques NGM répandit avec des isotopes stables et des bactéries par incubation subséquente pendant 2 heures sur des plaques NGM désétalé. Fait à noter, les vers cultivée en milieu liquide ont été lavés clair de marqueur isotopique et de bactéries dans trois volumes de base S. (voir protocole B); analyse GC / MS de lavages montré aucun enrichissement isotopique significative par le troisième lavage.

Worm meulage donné l'enrichissement maximal en métabolites intermédiaires. Afin d'optimiser l'enrichissement pour cent dans les conditions suivantes métabolites intermédiaires traitement similaire, la comparaison a été faite d'échantillons ver perturbé par sonication seul ou sonication, plus de meulage. La figure 3 montre que les vers perturbé l'exposition des isotopes suivants par sonication, plus de broyage avait plus que de l'enrichissement isotopique des échantillons perturbé uniquement par sonication. Ces données suggèrent que plusieurs sous-fractions organismique ont été perturbées par broyage que par sonication. Des études subséquentes ont révélé meulage seul sans sonication était suffisant pour atteindre maximale enrichissement isotopique (données non présentées).

L'exposition ver entier isotopique permet d'analyser le flux voie intermédiaire métabolique. Nourrir les vers qui vivent avec le précurseur de isotopique stable, soit pendant le développement (PROTOCOLE A, figure 4A) ou le début chez les animaux au stade adulte (PROTOCOLE B, figure 4B) permet une analyse sensible de l'enrichissement isotopique des métabolites indicatif de flux à travers la glycolyse (lactate, alanine), le pyruvate métabolisme (alanine), et le cycle de l'acide tricarboxylique (citrate, malate, le succinate, l'aspartate, le glutamate et la glutamine). Universellement marqué ¹³ C-glucose fournit l'étiquetage de toutes les espèces robustes de carbone, tandis que l'utilisation de 1,6 - ¹³ C _2-glucose permet d'étiquetage robustes que dans une espèce de chaque métabolite. Cette technique peut discerner des différences de sensibilité de type sauvage flux métabolique vers intermédiaire entre les souches de la chaîne respiratoire mitochondriale mutants, tels que le complexe III mitochondrial mutant de la chaîne respiratoire sous-unité isp-1 (qm150). La figure 5 illustre l'ampleur des différences observées dans l'étiquette absolue entre ISP-1 (qm150) et les vers N2 de chaque exposé pendant 24 heures pour 1,6 - ¹³ C _2-glucose dans la culture liquide avec K12 E. coli à partir du premier jour de la ponte au stade adulte jeune (protocole B). D'autres études isotopiques stables dans une gamme de mitochondries vers mutants sont en cours.

Figure 1. Universellement marqué ¹³ C-glucose isotopes stables a été bien intégrées dans les vers adultes jeunes de ¹³ CO _2: ^12. Ratio de CO ₂ (excès pour cent des atomes (APE), corrigée) de type sauvage (N2) vers suite à deux heures d'alimentation universellement étiqueté ¹³ C-glucose et UV soit tués ou vivants OP50 bactéries sur des plaques (PROTOCOLE C1). ¹³ l'incorporation C en métabolites ver a été robuste au bout de deux heures d'exposition d'isotopes. Barres bleues et rouges indiquent relatifs enrichissement isotopique en phase gazeuse («CO ₂ atmosphérique") et en phase liquide («CO ₂ vis sans fin»), respectivement.

Figure 2. L'exposition prolongée d'isotopes du début de la période larvaire et la suite de «clearing» des vers sur gélose NGM sans bactéries augmenté enrichissement isotopique de glutamate libre des vers adultes jeunes. Enrichissement isotopique des espèces glutamate est indiqué pour les vers nourris sur gélose NGM universellement marqué- ¹³ C-glucose et OP50 bactéries soit à travers le développement de la phase larvaire L1 par l'étape 959 cellules adultes jeunes ("L1", voir PROTOCOLE A), ou pendant quarante-huit heures à partir lorsque les vers ont atteint le premier jour de la ponte des jeunes stade adulte ("YA"). Axe des abscisses indique le nombre total d'atomes de carbone marqué dans chaque espèce de glutamate. Axe Y indique l'enrichissement pour cent (atomes corrigés par excès (APE)). Les barres vertes indiquent les vers suivants effacé l'exposition par l'alimentation des isotopes OP50 E. coli sans isotopique sur des plaques NGM pendant deux heures avant l'extraction de PCA. Barres bleues et grises indiquent les vers suivants effacé l'exposition isotopique sur des plaques NGM, sans bactéries ou d'isotopes pour deux ou six heures, respectivement, avant l'extraction de PCA.

Figure 3. Perturber les vers par broyage des rendements maximaux enrichissement isotopique des métabolites intermédiaires ver. Pour cent de l'enrichissement de carbone mesuré dans une espèce de citrate de vers de type sauvage traitées pendant 24 heures dans la culture liquide avec 1,6 - ¹³ C _2-glucose sans bactéries (protocole B). Des barres noires et grises indiquent les vers qui ont été perturbés par sonication seulement ou par sonication et le broyage, respectivement. Enrichissement isotopique après une exposition à 1,6 - ¹³ C _2-glucose est mieux évaluée en métabolites marqués sur un carbone. En revanche, l'étiquette est enrichie de toutes les espèces de chaque métabolite lors universellement ^marqué-13 C-glucose est utilisé.

Figure 4. Les résultats représentatifs illustrent l'ampleur de l'enrichissement isotopique en métabolites intermédiaires ver indicatif de flux à travers la glycolyse, le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Corrigé l'excès pour cent des atomes (APE) a été déterminée chez les jeunes adultes de type sauvage (N2 Bristol) vers suite 1, 6 à ¹³ C _2-glucose d'exposition (A) soit pendant le développement du stade L1 sur les plaques (protocole A), ou (B) à compter du premier jour de la ponte des œufs que les jeunes adultes de 24 heures en culture liquide (protocole B) . Les barres d'erreur indiquent l'écart-type lorsque des données fiables à partir de trois isotopique biologiques se réplique était disponible.

Figure 5. Absolute quantification d'acides aminés des espèces acide aminé métabolite de type sauvage et mitochondrial souches ver mutant. L'étiquette absolue dans chacune des espèces de quatre acides aminés a été calculée en multipliant par HPLC-déterminé sans la concentration d'acides aminés (protéines ver nmol / mg) par excès pour cent corrigées des atomes (APE) pour chaque espèce. Barres grises et noires indiquent type sauvage (N2 Bristol) et complexe mitochondrial souches sous-unité III mutant (ISP-1 (qm150)), respectivement. Les barres indiquent la moyenne de trois expériences biologiques répliquent par souche.

Discussion

En appliquant la spectrométrie de masse pour mesurer l'abondance isotopique en métabolites intermédiaires offre une image merveilleusement détaillée des changements biochimiques essentielles ^5. Ici, nous avons fourni des protocoles détaillés pour exploiter cette méthodologie très sensible et spécifique pour évaluer le flux métaboliques intermédiaire dans le modèle animal génétiquement polyvalent, C. elegans. En effet, l'alimentation des animaux qui vivent avec des isotopes stables étiquetés précurseurs métaboliques (comme le ¹³ C-glucose) permet un nouvel aperçu du flux voie intermédiaire métaboliques lors de la mesure d'enrichissement isotopique des métabolites en aval. Nous avons développé une méthodologie fiable pour obtenir une solide analyse des flux à travers la glycolyse, le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Ceci peut être réalisé à la fois chez les animaux nourris des isotopes stables du début des larves des stades de développement ou le début de la période post-mitotiques pour adultes. L'enrichissement isotopique de différentes espèces métabolite peut être étudiée en collaboration avec le ver gratuitement toute profilage des acides aminés par chromatographie liquide à haute performance, comme décrit précédemment ^4, afin de déterminer absolue enrichissement isotopique dans différentes espèces de l'alanine vers libre, l'aspartate, le glutamate et la glutamine. En effet, les modèles compatibles d'enrichissement isotopique sont obtenus lorsque l'on mesure des acides aminés et acides organiques dans les analytes aliquotes de 1.000 à 2.000 jeunes vers adultes synchrone. Cette méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d'intermédiaire dans le nucléaire basé sur les gènes mitochondriaux des souches mutantes par rapport aux vers de type sauvage.

Cette technique a une valeur pour enquêter sur des altérations spécifiques de flux dans les voies biochimiques de la pertinence par rapport aux communes des erreurs innées du métabolisme. En particulier, l'utilisation du glucose marqué avec des isotopes stables informe le flux de carbone à travers le centre des voies métaboliques de la pertinence d'une maladie mitochondriale. En effet, nos données suggèrent l'application d'une telle méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d'intermédiaire dans un réacteur nucléaire à base génétique sous-unité du complexe III mitochondrial souche mutante (ISP-1 (qm150)) par rapport à vers de type sauvage.

Il est important de reconnaître que depuis l'exposition isotopique est terminée sur une période de un à plusieurs jours, quantifiés enrichissement isotopique représente une valeur "état stationnaire" enrichissement plutôt que de flux quantifiables sur une période de temps définie, tels que fixés dans la cellule à base de modèles exposés à des isotopes pour une période de minutes à plusieurs heures. Une autre limite potentielle d'interroger le flux voie au cours du développement des nématodes se rapporte à différentes longueurs du développement larvaire qui se produisent, en particulier les souches mutantes. Par exemple, beaucoup de graves mutations mitochondriales sont connus pour provoquer un arrêt lors de la troisième (L3) stade larvaire ^6. Ainsi, l'analyse de l'incorporation d'isotopes que chez les animaux qui survivent à l'âge adulte peut ne pas être représentatifs de toute la population mutante. Toutefois, cette méthodologie pourrait être adaptée afin d'évaluer l'incorporation isotopique en métabolites intermédiaires à un stade larvaire spécifique (comme L2) plutôt que d'attendre que les animaux d'atteindre le stade adulte. De même, les animaux qui entrent dans le stade alternatif connu sous le nom de larves dauer probablement considérablement modifié (probablement inférieur) métaboliques flux relatif aux animaux qui procèdent directement à travers les quatre stades larvaires. Les futures études pourraient également être réalisées pour évaluer directement l'incorporation isotopique des animaux étape dauer des différents fonds génétiques. Exposer les animaux à des isotopes stables pour une période déterminée (ici, 24 à 48 heures) en commençant une fois les animaux ont atteint le stade adulte jeune (comme détaillé dans le Protocole B) élimine l'impact de la variable de périodes de développement. Alors que ¹³ C-glucose interroge seule la glycolyse, le métabolisme du pyruvate et de flux cycle de l'acide tricarboxylique, d'autres traceurs isotopiques pourraient être évalués à interroger le flux voie biochimique par d'autres voies d'intérêt chez les nématodes. Par exemple, ¹⁵ N-glycine pourrait être utilisé pour évaluer le chiffre d'affaires d'acides aminés dans les nématodes.

Une autre limite potentielle de cette approche est le niveau de sensibilité de la détection de métabolites. Notre expérience suggère un minimum de 500 nématodes adultes jeunes sont requises pour mener à quantifier l'incorporation isotopique par les méthodes HPLC et GC / MS employé ici. L'utilisation d'instruments avec une plus grande sensibilité, comme la chromatographie liquide ultra (UPLC), peut permettre une nouvelle réduction du nombre d'animaux étudiés, même si nous pensons que ce n'est probablement pas pour permettre une quantification fiable de métabolites et d'incorporation isotopique en espèces de vers métabolite unique. Nous avons étudié les populations de vers de 1000 animaux par expérience, que nous avons trouvé détecter de façon fiable métabolites de faible abondance dans chaque souche. Cependant, certains métabolites, tels que le GABA, ne peuvent être quantifiés de manière fiable dans des populations beaucoup plus de nématodes, de l'ordre de1x10 ⁶ animaux ^4.

En résumé, le profilage des isotopes stables fournit un non-invasive et sûre (non radioactif) approche qui a longtemps été utilisé pour étudier les erreurs innées du métabolisme. L'application de cette méthodologie à C. elegans fournit la capacité nouvelle pour examiner in vivo et en temps réel, des altérations métaboliques qui se produisent au niveau de l'animal entier, qui peuvent résulter de différents troubles génétiques et / ou expositions agent pharmacologique.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D