Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Resumo

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no nematóide, Caenorhabditis elegans. Métodos são detalhados para avaliar enriquecimento isotópico em dióxido de carbono, ácidos orgânicos e aminoácidos após a exposição de isótopos, quer durante o desenvolvimento em placas de agar ou durante a vida adulta na cultura líquido.

Resumo

Perfis isotópicos estáveis ​​há muito tempo permitido investigações sensíveis das conseqüências metabólicas de mutações genéticas e / ou terapias farmacológicas em modelos celulares e mamíferos. Aqui, descrevemos os métodos detalhados para traçar um perfil isotópico estável de metabolismo intermediário e fluxo metabólico na nematóide, Caenorhabditis elegans. Métodos são descritos para perfilar toda verme aminoácidos livres, dióxido de carbono marcado, rotulado ácidos orgânicos, aminoácidos e rotulado em animais expostos a ambos os isótopos estáveis ​​de desenvolvimento inicial em mídia nematóide crescimento agar placas ou começando como adultos jovens, porém expostos a vários tratamentos farmacológicos em cultura líquida. Aminoácidos livres são quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em alíquotas verme todo extraído em 4% de ácido perclórico. Universalmente rotulados ¹³ C-glicose ou 1,6 - ¹³ C _2-glicose é utilizada como precursor estável isotópica de carbono, cujo rótulo é rastreado por espectrometria de massa de dióxido de carbono (ambos da atmosfera e dissolvido), bem como em metabólitos indicativo de fluxo através da glicólise , metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Resultados representativos são incluídos para demonstrar os efeitos do tempo de exposição de isótopos, vários protocolos de limpeza bacteriana e métodos de interrupção alternativa verme em tipo selvagem nematóides, bem como a extensão relativa de incorporação isotópica no complexo III mitocondrial mutante worms (isp-1 (qm150) ) em relação ao tipo selvagem worms. Aplicação de perfis isotópica estável em nematóides de vida proporciona uma capacidade inovadora para investigar a todo o nível animal alterações em tempo real metabólicos que são causadas por doenças genéticas individuais e / ou terapias farmacológicas.

Protocolo

Protocolo A: perfil isotópica estável de metabolismo intermediário durante C. elegans desenvolvimento em placas NGM.

* Nota: o enriquecimento de isótopos estáveis ​​podem ser medidos com sucesso em populações de nematóides adultos jovens, após a exposição de isótopos (com glucose ou C universalmente marcado ¹³ ou 1,6 - ¹³ C _2-glucose) início ou no início do desenvolvimento ou no início da idade adulta. Este protocolo facilita o monitoramento simultâneo de saúde animal, desenvolvimento e crescimento no padrão de crescimento de nematóides media (NGM) placas, que não é tão facilmente alcançada na cultura líquido.

1. Preparar 100 milímetros pratos de Petri com 10 mL de meio de crescimento de nematóides (NGM), por técnica padrão ^1.
2. Espalhe placas NGM com OP50 E. coli ¹ e deixar secar durante a noite.
3. Adicionar 500 mL de 200 mm 1,6 - ¹³ C ₂ glicose (para alcançar uma concentração final de 10 mM na placa NGM) uniformemente ao prato. Deixe secar durante a noite.
4. Bleach gravid vermes adultos ^1. Placa recuperado ovos em placas NGM sem bactérias ou 1,6 - ¹³ C ₂ glicose. Incubar a 20 ° C durante a noite.
5. No dia seguinte, a transferência chocados, as larvas L1-presos em placas NGM anteriormente espalhar com 1,6 - ¹³ C _2-glicose e OP50 E. coli (por etapa 2, acima). Worms crescem a fase de adulto jovem (48-72 horas, dependendo da tensão), worms tomar cuidado não morrer de fome.
6. Coletar síncrono, primeiro dia vermes adultos jovens de placas com 3-4 mL de S. Basal.
7. Lavar worms em 50 mL de S. Basal em 50 mL tubos Falcon. Worms permitem a pelota pela gravidade por 5 minutos. Remover o sobrenadante para ~ 5 mL. Repita lavar mais duas vezes.
8. Estimar o número sem-fim, contando três alíquotas 100 mL ^2. Ajuste a concentração worm worms 1000 / mL de S. basal.
9. Pipetar 1 mL (1000 worms) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL de plástico.
10. Adicionar 69 mL de 60% PCA contendo padrão interno (ε-aminocapróico) para uma concentração final de PCA 4% e 200 mmol de padrão interno.
11. Vamos resolver worms pela gravidade x 5 minutos. Remova e guarde o sobrenadante em outro tubo.
12. Moer amostras de plástico worm usando homogeneizador (Kontes Pellet pilão) e motorizados de perfuração (Kontes Pellet Motor Pestle Cordless) por 15 segundos. Confirmar visualmente interrupção verme por microscopia de luz. Repita se necessário.
13. Transferir o sobrenadante do passo 11 para combinar com homogeneizado a partir da etapa # 12.
14. Centrífuga de amostra em 2250 rpm (1300 xg) por 5 minutos.
15. Transfira o sobrenadante para novo tubo de vidro de 7 mL. Salve pelotas para ensaio de concentração de proteína, conforme detalhado na etapa n º 20, abaixo.
16. amostras de pH a 7-8 gama (neutro), usando 4N KOH.
17. Centrifugar amostras neutralizadas em 7 mL tubo de vidro em 2250 rpm (1300 xg) por 5 minutos para remover os sais.
18. Transfira o sobrenadante para novo tubo de vidro de 7 mL.
19. Preparar amostras para quantificação metabólito neutralizado por:
    1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC): 50 mL de amostra independente neutralizado por injecção directa no HPLC. Quantificação de aminoácidos livres é realizada por HPLC (Varian), utilizando derivatização pré-coluna com detecção o-ftalaldeído e fluorescentes, como descrito anteriormente ^3-4.
    2. Cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa (GC / MS): Prossiga com a extração de amostras restantes neutralizado com resina de troca iônica (Bio-Rad) para GC / MS determinação do enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos, conforme detalhado no PROTOCOLO D.
20. Adicionar 1 mL de NaOH 1N em permanecer proteína pellet (a partir da etapa # 15) em 7 tubo de vidro mL.
21. Incubar NaOH tratados com proteína da amostra em temperatura ambiente durante a rotação (Labnet * Rotator LabRoller) durante a noite até dissolver.
22. Use 75-100 mL de NaOH tratados com proteína para determinar a concentração de proteína por métodos padrão (DC Protein Assay, Bio-rad).

Protocolo B. perfil Estável isotópica do metabolismo intermediário em C. adultos jovens elegans na cultura líquido.

* NOTA: Os efeitos farmacológicos no fluxo intermediário metabólico em nematóides adultos podem ser estudados após início da exposição isotópica no primeiro dia de postura de ovos ou em placas NGM (ver Protocolo A, acima) ou em cultura líquida. Nós preferimos a segunda abordagem para maximizar a eficiência de custo e utilização de isótopos estáveis ​​agente farmacológico.

1. Diluir síncrono, primeiro dia do egg-laying jovens adultos em S. basal contendo colesterol 0,0005% (obtido pela adição de 0,5 mL de 1% de colesterol (dissolvido em etanol 95%) para 1L de S. Basal) até 2000 animais por 500 mL.
2. Configurar ~ 4 mL cultura volume total (s) em balões de 25 mL Erlenmeyer, como segue:

   TRATAMENTO:	NONE	"A DROGA"
   S. Basal com colesterol	3020 mL	3020 uL - "A Droga" volume
   Isótopo estável (1,6 - 13 C 2-glucose)	80 mL	80 mL
   K12 E. coli (OD 660 2,5-3)	400 mL	400 mL
   Vermes adultos jovens (2.000)	500 mL	500 mL
   A droga (concentração desejada)	-	Como desejado

3. Cobrir frascos com papel alumínio. Agitar frascos por 24 horas a 220 rpm em 20 ° C incubadas plataforma shaker.
4. Certifique-se de frascos não são completamente fechados, como o oxigênio é necessário para o fluxo metabólico intermediário e para a rotulagem de metabólitos resultantes nematóide endógena.
5. Lavar worms, adicionando 4 mL volume de cultura a 46 mL de S. basal em um tubo de plástico 50 mL cônico. Worms permitem a pelota pela gravidade por 5 minutos. Sucção a vácuo sobrenadante até ~ 5 mL permanece. Repita por lavagem de recarga de tubo mais duas vezes para 50 mL com S. basal.
6. Concentrar worms worms lavada para 1000 / mL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL de plástico.
7. Adicionar 69 mL de 60% de ácido perclórico (PCA) e 2 mL de 10 mM padrão interno (ε-aminocapróico) para alcançar uma concentração final de 200 mmol padrão interno e PCA 4%.
8. Prepare amostras como passos por # 11-22 em A. PROTOCOLO

PROTOCOLO C-1. Monitoramento da utilização de isótopos em vermes adultos em placas traçando carbono marcado em dióxido de carbono atmosférico e dissolvidos.

* NOTA: Considerando PROTOCOLOS A e B detalhes métodos para monitorar a incorporação de isótopos em metabólitos livres dentro de worms mais de 2-3 dias de desenvolvimento ou um dia da vida adulta, respectivamente, a confirmação bruta do sucesso e da cinética de incorporação isotópica mais de um curso curto espaço de tempo (ie, minutos ou horas) pode ser alcançado pelo selo de monitoramento em dióxido de carbono atmosférico (CO ₂₎ liberado de worms ou contida em dióxido de carbono dissolvido no extrato de worm. Bactérias vivas ou mortas pode ser transmitido para worms quando cultivadas em placas (PROTOCOL C-1). Bactéria não é necessário para exposição de curta duração isótopo de worms na cultura líquido (PROTOCOLO C-2).

1. Preparar 100 milímetros pratos de Petri com 10 mL de agar NGM. Espalhe placas com NGM vivo ou morto UV-OP50 E. coli (como demonstrado na Figura 1). Permitir que as placas para secar durante a noite.
2. Adicionar 500 mL de 200 mM ^{1,6-rotulada-13} C ₂ glucose-OP50 para espalhar placas NGM (para a concentração de isótopos final de 10 mM na placa NGM). Permitir que as placas para secar durante a noite.
3. Obter síncrono, primeiro dia de postura, vermes adultos jovens cultivadas em placas de ágar NGM espalhou apenas com OP50 E. coli.
4. Transferência de 1000 vermes adultos jovens para placas NGM experimental agar contendo isótopos estáveis ​​e E. coli (preparadas como passos por # 1-2, acima).
5. Coloque placa NGM experimental (sem tampa), em câmara de vidro personalizado equipado com bem fechados torneira de 3 vias para permitir a amostragem atmosfera precisa e de substituição. Imediatamente selo câmaras com disco de vidro opticamente transparentes. Cobrir costura onde o vidro do disco fica na placa com graxa de alto vácuo para selar. Tempo recorde como "0 Time".
6. ML de amostra de 10 da atmosfera da câmara de vidro por 3 vias torneira com uma seringa de 20 mL em 30 minutos, 60, 90 e 120. Transferência de cada amostra atmosférica a um pré-preparados rolha de borracha 10 mL coberto tubo de vidro contendo 1 mL de 1 mM NaHCO ₃ em 0,1 N NaOH que foi selado a vácuo.
7. Injectar 10 ml de ar em volta de cada câmara de vidro por meio de torneira de 3 vias, utilizando uma seringa de 20 mL. Fechar torneira para a câmara após a amostragem / reinjetou atmosfera e antes de retomar a incubação entre os pontos de tempo de coleta.
8. Injectar 100 mL de ácido fosfórico 20% através de rolha em 10 mL rolha de borracha coberto tubo de vidro contendo atmosférica de CO ₂ da amostra.
9. Retire 2 mL da atmosfera e injetá-lo em 12 mL azul-top amostrador automático de tubos pré-cheia com hélio para CO ₂ atmosférico de medição.
10. Analisar "atmosférica de CO ₂ amostras" por Gas-Ratio Mass Spectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Abra câmaras de vidro seguintes duas horas isótopo período de incubação e recolha de todas as amostras atmosféricas.
12. Lavar worms off de placas NGM com 3 mL de S. basal.
13. Lavar worms em 50 basal S. mL em 50 mL tubos Falcon. Repita lavar mais duas vezes.
14. Concentre-se para worms worms ~ 1000 / mL em 7 mL tubo de vidro de fundo redondo (s).
15. Tubo de vácuo de vidro com tampa de borracha de vedação.
16. Adicionar 100 mLde ácido fosfórico 20% através de rolha de borracha com seringa para liberar o CO ₂ dissolvido.
17. Retire 2 mL da atmosfera e injetar 12 mL azul-top amostrador automático de tubos pré-cheia com hélio para medição de CO ₂ dissolvido.
18. Analisar "o CO ₂ dissolvido amostras" por Gas-Ratio Espectrômetro de Massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Alternativa Protocol (C-2): utilização Monitoramento isotópica em vermes adultos na cultura líquido traçando carbono marcado em dióxido de carbono atmosférico e dissolvidos.

1. Obter síncrono, primeiro dia de postura de ovos, vermes adultos jovens cultivadas em placas de ágar NGM espalhar com OP50 E. coli.
2. Lavar worms em 50 mL de S. basal em 50 mL tubos Falcon. Worms permitem a pelota pela gravidade por 5 minutos. Remover o sobrenadante para ~ 5 mL. Repita mais duas vezes lava.
3. Transferência de 1000 vermes adultos jovens em uma basal S. mL a 10 mL tubo de vidro de fundo redondo. Adicionar 10,1 mL de 1 M de ações universalmente marcado ¹³ C-glicose a 1 mL de worms para atingir a concentração final de 10 mM.
4. Oxigenar o tubo de vidro de fundo redondo contendo isótopos worms e pela troca de atmosfera com oxigênio a 100% fluindo no tubo aberto por 2 minutos. Fechar imediatamente tubo com rolha de borracha.
5. Agitar os tubos experimental em 20 ° C incubadas plataforma shaker a 220 rpm. Registro de partida o tempo como "0 Time".
6. ML de amostra 5 da atmosfera a partir de 10 mL tubo de vidro de fundo redondo com uma seringa de 10 mL e agulha de calibre 25 através da rolha de borracha no minuto 30, 60, 90 e 120.
7. Transferência de cada amostra atmosférica a uma rolha de borracha pré-preparados, coberto 10 tubo de vidro contendo 1 mL mL de 1 mM NaHCO ₃ em 0,1 N NaOH que foi selado a vácuo.
8. Injetar 5 mL de ar em volta de cada tubo de vidro experimental de fundo redondo contendo worms e isótopo através rolha de borracha com uma seringa de 10 mL e agulha de calibre 25.
9. Currículo de incubação de 10 mL experimental tubos de fundo redondo de vidro, contendo vermes e isótopo agitando a 220 rpm entre os pontos de tempo de coleta.
10. Injectar 100 mL de ácido fosfórico 20% através de rolha na atmosfera contendo rolha de borracha coberto 10 tubo de vidro mL.
11. Retire 2 mL da atmosfera e injetar 12 mL azul-top amostrador automático de tubos pré-cheia com hélio para CO ₂ atmosférico de medição.
12. Analisar "atmosférica de CO ₂ amostras" por Gas-Ratio Mass Spectrometer (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. No final do período experimental, lave worms em 50 basal S. mL em 50 mL do tubo Falcon. Permitir verme pellet para formar pela gravidade. Sucção a vácuo sobrenadante até ~ 5 mL permanece. Repita mais duas vezes por lavagem em 50 mL de S. basal.
14. Concentre-se para worms worms ~ 1000 / mL em 7 mL tubo de vidro de fundo redondo. Adicionar rolha de borracha e tubo de selo de vácuo. Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 20% com uma seringa de 1 mL com uma agulha calibre 25 através da rolha de borracha para liberar CO ₂ dissolvido verme.
15. Retire 2 mL atmosfera e injetar 12 mL azul-top amostrador automático de tubos pré-cheia com hélio para medição de CO ₂ dissolvido.
16. Analisar "o CO ₂ dissolvido amostras" por Gas-Ratio Espectrômetro de Massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protocolo D. Processamento neutralizado amostras de protocolos A e B para a análise de aminoácidos e ácidos orgânicos por espectrometria de cromatografia gasosa / massa.

1. Preparação talão:
   1. Adicione 1 N HCl tanto Ag 1 e 50 Ag contas separadamente em copos 1L.
   2. Mexa cada frasco por 30 minutos com agitador magnético.
   3. Lavar com água deionizada contas 10 vezes até que o pH de lavagens são iguais ao pH da água.
2. Preparação da coluna:
   1. Colocar um tampão de algodão logo acima da parte mais estreita da pipeta Pasteur ponta.
   2. Adicionar contas cobrado a cada um duas colunas por exemplo, enchendo cada um para aproximadamente um terço da altura da coluna. Use AG1 contas para a extração de ácidos orgânicos. Use AG50 contas para a extração de aminoácidos.
3. Processamento da amostra:
   1. Adicionar 500 mL de amostra para a coluna com contas AG1 cobrado. Nada é adicionado à amostra (ver PROTOCOLO A, a etapa # 19B) antes de aplicar a AG1 coluna para extrair ácidos orgânicos, se a amostra já está em pH neutro.
   2. Adicionar 1 mL de 0,1 N HCL à amostra restante antes de aplicá-la à coluna AG50 para extrair aminoácidos.
   3. Deixe que as amostras para executar completamente através de colunas.
   4. Lavar coluna com água 10 vezes até lavagens são neutros (7-8 faixa de pH).
   5. Eluir colunas a fresco, rotulados de vidro 4 frascos mL de amostra:
      1. Para a extração de ácidos orgânicos, adicione 3 mL de HCl 3 N para AG1 coluna. Isto permite a análise do enriquecimento isotópico em número total de carbonos marcados entre os três espécies de carbono (lactato), 4-carbono espécies (aspartato, succinato, malato),5 carbonos espécies (glutamato), e 6 de carbono-espécies (citrato).
      2. Para a extração de aminoácidos: adicionar 3 mL de 4 N NH ₄ OH a AG50 coluna. Isto permite a análise do enriquecimento isotópico em número total de carbonos marcados entre os três espécies de carbono (alanina) e 5-carbono espécies (glutamina).
   6. Coloque os frascos de amostra em evaporador III reativação Vap-noite até secar.

E. Derivitization Sample and Settings Máquina para Espectrometria de Massa

Adicionar 50 mL de acetonitrila e 50 mL de n-metil-nt-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) para cada frasco de amostra. Cobertura, misturar e incubar durante 30 minutos a 60 ° C. Injetar 1-2 mL por amostra em Espectrômetro de Cromatografia Gasosa / massa (GC / MS).

F. Análise dos Resultados

1. Quantificação dos picos de aminoácidos. Quantificação de cada aminoácido por HPLC é calculado usando a área de cada pico em relação à do padrão interno.
2. Cálculo enriquecimento isotópico. Enriquecimento isotópico estável é calculado no Excel (Microsoft) para cada espécie de acordo com a seguinte fórmula: Excesso Percent Atom, corrigido (APE) = (R _{sa-R st)} * 100 / [(R _{sa-R st)} 100], onde R _sa - Razão da amostra e R _st - Relação entre o padrão.
3. Avaliar diferenças estatísticas entre o enriquecimento da amostra. Student t-teste é utilizado para avaliar o significado dos aminoácidos em relação e as diferenças entre as amostras etiqueta isotópica.

Resultados representativos:

Isótopo estável é bem incorporados vermes adultos jovens, como evidenciado por carbono marcado medido em CO ₂ e CO 2 dissolvido verme. Em vermes alimentados vivos ou UV-irradiados matou OP50 E. coli, a proporção de ¹³ CO CO _{^02-12 fevereiro} foi maior no verme CO ₂ dissolvido fração em relação ao CO ₂ atmosférico lançado (Figura 1). Worms alimentação vivo ou morto OP50 E. coli não alterou significativamente a medida ¹³ CO ^_2-12 CO ₂ em razão de extrato de verme lavada (ver PROTOCOLO C1).

A exposição prolongada ao isótopo estável do início do período larval aumentou enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários. Excesso Percentual corrigido átomos de carbono marcado determinado em metabólitos intermediários de jovens adultos de tipo selvagem worms foi maior em todas as espécies de glutamato quando worms foram alimentados universalmente marcado ¹³ C-glicose e bactérias vivem ao longo do desenvolvimento em relação aos animais tratados de forma similar alimentados bactérias marcadas para 48 apenas algumas horas depois de atingir a postura fase adulta (Figura 2).

Efeito de compensação vezes em enriquecimento isotópico. Independentemente da timecourse exposição, todos os animais foram cultivadas em placas 'limpo' de isotópicos rótulo antes da preparação para a jusante GC / MS analisa. Comparação de protocolos de limpeza foi realizada como mostrado na Figura 2, incluindo a alimentação worms por 2 horas em placas de agar NGM espalhar com bactérias vivas fresca sem isotópica ou alimentando-se de placas de ágar NGM sem bactérias por 2 horas, e alimentando-se de placas de ágar NGM sem bactérias para 2 ou 6 horas. Independentemente do curso de exposição isotópica, não houve diferença significativa no enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários do extrato verme adulto jovem toda foi observado quando os animais foram apuradas em placas sem bactérias para 2 ou 6 horas. Por outro lado, o enriquecimento isotópico menos foi observada em metabólitos intermediários quando os animais foram posteriormente "limpo" do isótopo excesso de alimentação de bactérias não marcado por duas horas. No entanto, o aumento de enriquecimento em três, quatro, e cinco espécies foi evidente quando os vermes foram expostos ao isótopo do início do período larval. Portanto, o protocolo de limpeza ideal foi determinado para ser clearing worms após a sua incubação em placas NGM espalhar com isótopos estáveis ​​e bactérias pela posterior incubação por 2 horas em placas NGM unspread. De nota, worms cultivadas em cultura líquida foram lavadas clara do rótulo isotópica e bactérias em três volumes de S. basal (ver protocolo B); GC / MS a análise de lavagens não apresentaram enriquecimento isotópico significativo pela terceira lavagem.

Worm moagem rendeu enriquecimento máximo em metabólitos intermediários. Para otimizar o enriquecimento por cento em metabólitos intermediários seguintes condições de tratamento semelhantes, a comparação foi feita de amostras de vírus interrompido por sonicação ou sonicação sozinho mais de retificação. A Figura 3 mostra que os worms interrompido exposição isótopo seguintes por sonicação além de moagem teve maior enriquecimento isotópico do que as amostras interrompido apenas por sonicação. Estes dados sugerem que as frações mais sub-organismal foram interrompidas por trituração do que por sonicação. Estudos subseqüentes revelaram moer sozinho, sem sonication foi suficiente para alcançar o enriquecimento isotópico máxima (dados não mostrados).

Exposição verme toda isotópica permite a análise de fluxo intermediário via metabólica. Alimentação vermes que vivem com o precursor isotópica estável durante o desenvolvimento (PROTOCOL A, Figura 4A) ou a partir de animais fase adulta (PROTOCOL B, Figura 4B) permite análise de sensibilidade de enriquecimento isotópico entre os metabólitos indicativo de fluxo através da glicólise (lactato, alanina), piruvato metabolismo (alanina), eo ciclo do ácido tricarboxílico (citrato, malato, succinato, aspartato, glutamato e glutamina). Universalmente marcado ¹³ C-glicose fornece etiquetagem robusta de todas as espécies de carbono, enquanto que a utilização de 1,6 - ¹³ C _2-glicose permite etiquetagem robusta apenas em uma espécie de cada metabólito. Esta técnica pode discernir as diferenças de sensibilidade do tipo selvagem fluxo metabólico verme intermediário entre cepas cadeia respiratória mitocondrial mutante, como o complexo III da cadeia respiratória mitocondrial da subunidade mutante isp-1 (qm150). A Figura 5 ilustra a magnitude das diferenças observadas na etiqueta absoluta entre isp-1 (qm150) e worms N2 cada expostos por 24 horas para 1,6 - ¹³ C _2-glicose em cultura líquida com K12 E. bactéria Escherichia desde o primeiro dia do egg-laying fase de adulto jovem (protocolo B). Adicionais estável estudos isotópicos em uma série de worms mitocondrial mutante estão em andamento.

Figura 1. Universalmente marcado com isótopo ¹³ C-glicose estável foi bem incorporados vermes adultos jovens ¹³ CO _2: ^12. Rácio de CO ₂ (átomos em excesso por cento (APE), corrigido) no tipo selvagem (N2) worms duas horas seguintes alimentação universalmente rotulados ¹³ C-glicose e quer UV-morto ou vivo OP50 bactérias em placas (PROTOCOL C1). ¹³ C incorporação metabólitos worm foi robusta após duas horas de exposição isótopo. Barras azuis e vermelhas indicam enriquecimento isotópico relativo em fase gasosa ("atmosférica de CO _2") e fase líquida ("verme CO _2"), respectivamente.

Figura 2. Exposição prolongada isótopo do início do período larval e, posteriormente, 'clearing' worms em placas de agar NGM sem bactérias aumentou enriquecimento isotópico em glutamato livre de vermes adultos jovens. Enriquecimento isotópico em espécies glutamato é mostrado para worms alimentados com placas de ágar NGM com universalmente marcado- ¹³ C-glicose e OP50 bactérias ou ao longo do desenvolvimento do estágio larval L1 através do 959 fase adulta de células jovens ("L1", ver PROTOCOLO A), ou para 48 horas início, quando worms atingiu o primeiro dia do egg-laying jovens fase adulta ("YA"). Eixo X indica o número total de átomos de carbono marcado em cada espécie de glutamato. Eixo Y indica o enriquecimento por cento (átomos corrigido por excesso (APE)). Barras verdes indicam worms apuradas exposição isótopo seguir alimentando OP50 E. coli sem isótopo em placas NGM por duas horas antes da extração PCA. Barras azul e cinza indicam worms apuradas exposição isótopo seguir em placas NGM sem bactérias ou isótopo por dois ou seis horas, respectivamente, antes da extração PCA.

Figura 3. Interromper worms por trituração rende enriquecimento isotópico máxima em metabólitos intermediários verme. Por cento de enriquecimento de carbono medido em uma espécie de citrato de tipo selvagem worms tratados por 24 horas de cultura líquido com 1,6 - ¹³ C _2-glicose sem bactérias (PROTOCOL B). Barras pretas e cinza indicam vermes que foram rompidas por sonicação só ou por sonicação e moagem, respectivamente. Enriquecimento isotópico após a exposição a 1,6 - ¹³ C _2-glicose é a melhor avaliada em metabólitos identificados em um carbono. Em contraste, o rótulo é enriquecido em todas as espécies de cada metabólito quando universalmente ^rotulados-13 C-glicose é utilizado.

Figura 4. Resultados representativos ilustrar o grau de enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários verme indicativo de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Corrigida por cento o excesso de átomos (APE) foi determinada em adultos jovens do tipo selvagem (N2 Bristol) worms seguintes 1, ^6-13 C exposição _glucose-2 ou (A) durante o desenvolvimento do estágio L1 em placas (PROTOCOL A), ou (B), com início no primeiro dia do egg-laying como jovens adultos de 24 horas de cultura líquido (PROTOCOLO B) . Barras de erro indicam o desvio padrão, onde confiável de dados isotópicos de três repetições biológicos disponíveis.

Figura 5. Quantificação de ácido amino absoluta de espécies de aminoácidos metabólito no tipo selvagem e mitocondrial cepas verme mutante. Label absoluta em cada espécie de quatro aminoácidos foi calculada multiplicando-HPLC determinada concentração de aminoácidos livres (nmol / mg de proteína worm) por excesso corrigido átomos por cento (APE) para cada espécie. Barras cinzentas e pretas indicam tipo selvagem (N2 Bristol) e mitocondrial complexo subunidade III cepas mutantes (isp-1 (qm150)), respectivamente. As barras indicam a média de três experimentos biológicos replicar por tensão.

Discussão

Aplicação de espectrometria de massa para medir a abundância isotópica em metabólitos intermediários proporciona uma imagem detalhada de crítica maravilhosamente alterações bioquímicas ^5. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para explorar esta metodologia altamente sensível e específico para avaliar fluxo metabólico intermediário no modelo animal geneticamente versáteis, C. elegans. Na verdade, a alimentação dos animais que vivem com o isótopo estável rotulados precursores metabólicos (tais como ¹³ C-glicose) permite uma visão romance em fluxo intermediário via metabólica quando se mede o enriquecimento isotópico em metabólitos jusante. Temos desenvolvido metodologia confiável para obter análise robusta de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Isto pode ser conseguido tanto em animais alimentados com isótopo estável desde o início de estágios de desenvolvimento larval ou início no período pós-mitóticas adulto. Enriquecimento isotópico em diferentes espécies metabólito pode ser estudada em conjunto com todo perfil de ácido amino verme livre por cromatografia líquida de alta eficiência, como descrito anteriormente ^4, para determinar o enriquecimento isotópico absoluta em diferentes espécies de verme livre alanina, aspartato, glutamato e glutamina. De fato, padrões consistentes de enriquecimento isotópico são obtidos quando a medição de aminoácidos e ácidos orgânicos analitos em alíquotas de 1.000 a 2.000 jovens adultos worms síncrona. Tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em gene nuclear baseado mitocondrial cepas mutantes em relação ao tipo selvagem worms.

Esta técnica tem valor para investigar alterações no fluxo específico vias bioquímicas comuns de relevância para erros inatos do metabolismo. Em particular, a utilização de glicose marcada com isótopo estável informa fluxo de carbono através de vias metabólicas centrais de relevância para doença mitocondrial. De fato, nossos dados sugerem a aplicação de tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em um gene nuclear baseado complexo mitocondrial da subunidade III cepa mutante (isp-1 (qm150)) em relação ao tipo selvagem worms.

É importante reconhecer que, desde a exposição isotópica é completada por um período de um a vários dias, quantificados enriquecimento isotópico representa um "estado estacionário" valor de enriquecimento, em vez de fluxo quantificável durante um período definido de tempo, como pode ser determinada em células baseado em modelos expostos ao isótopo por um período de minutos a horas. Outra limitação potencial de interrogar fluxo percurso ao longo do desenvolvimento do nematóide se relaciona com diferentes comprimentos de desenvolvimento larval que ocorrem em particular cepas mutantes. Por exemplo, muitos graves mutações mitocondriais são conhecidos por causar prisão na terceira fase larval (L3) ^6. Assim, a análise de isótopos de incorporação apenas em animais que sobrevivem até a idade adulta pode não ser representativa de toda a população mutante. No entanto, esta metodologia pode ser adaptada para avaliar incorporação isotópica em metabólitos intermediários em um estágio específico de larva (como L2) em vez de esperar para os animais para chegar à fase adulta. Da mesma forma, os animais que entram no estágio larval alternativa conhecida como Dauer provavelmente alteraram significativamente fluxo metabólico (baixa probabilidade) em relação aos animais que proceda diretamente através das quatro fases larval. Estudo futuro também pode ser realizada para avaliar diretamente a incorporação isotópica em animais estágio Dauer de diferentes backgrounds genéticos. Exposição dos animais ao isótopo estável por um período de tempo fixo (aqui, 24 a 48 horas), começando uma vez animais atingiram a fase adulta jovem (conforme detalhado no Protocolo B) remove o impacto da variável períodos de desenvolvimento. Enquanto ¹³ C-glicose apenas interroga metabolismo, glicólise piruvato e fluxo de Ciclo do ácido cítrico, outros traçadores isotópicos poderiam ser avaliados para interrogar fluxo caminho bioquímico através de outras vias de interesse em nematóides. Por exemplo, ¹⁵ N-glicina pode ser utilizada para avaliar volume de negócios de aminoácidos em nematóides.

Outra limitação potencial desta abordagem é o nível de sensibilidade da detecção de metabólito. Nossa experiência sugere um mínimo de 500 nematóides adultos jovens são necessários para quantificar com sucesso incorporação isotópica pelos métodos HPLC e GC / MS empregada aqui. Utilização de instrumentos com maior sensibilidade, como cromatografia ultra-desempenho líquido (UPLC), pode permitir uma maior redução do número de animais estudados, embora nós antecipamos isso é improvável para permitir a quantificação confiável de metabólitos e incorporação isotópica em espécies metabólito de worms único. Foram estudadas populações verme de 1.000 animais por experiência, que nós encontramos para detectar confiavelmente metabólitos baixa abundância em cada tensão. No entanto, alguns metabólitos, tais como GABA, só pode ser confiavelmente quantificados em populações muito maiores de nematóides, na ordem de1x10 ⁶ animais ^4.

Em resumo, o perfil de isótopos estáveis ​​é um não-invasivo e seguro abordagem (não radioativos) que tem sido utilizada para estudar os erros inatos do metabolismo. Aplicação desta metodologia para C. elegans fornece a capacidade de romance para investigar in vivo, em tempo real, alterações metabólicas que ocorrem no nível animal inteiro, o que pode resultar de doenças genéticas individuais e / ou exposições agente farmacológico.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D