L'isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

Résumé

Un protocole pour l'isolement et l'activation de spermatides de mâle C. elegans Est décrit ici. Couper l'extrémité postérieure de spermatides communiqués de sexe masculin. Les spermatides peuvent être activés par l'ajout de protéase.

Résumé

Les mâles et les hermaphrodites sont les deux formes sexuelles naturellement trouvé dans le nématode C. elegans. Les spermatozoïdes sont produits par amiboïde deux mâles et hermaphrodites. Dans la phase antérieure de la gamétogenèse, les cellules germinales des hermaphrodites se différencier en un nombre limité de sperme - environ 300 - et sont stockés dans un petit «sac» appelé la spermathèque. Plus tard, les hermaphrodites produisent continuellement ovocytes ^1. En revanche, les mâles produisent des spermatozoïdes exclusivement au long de leur vie adulte. Les mâles produisent des spermatozoïdes, si bien qu'il représente> 50% des cellules totales dans un ^deux ver adulte typique. Par conséquent, isoler les spermatozoïdes de mâles est plus facile que de celui des hermaphrodites.

Seule une faible proportion d'hommes sont naturellement généré spontanée due à la non-disjonction des chromosomes X ^3. Traversée hermaphrodites avec des mâles ou plus commodément, l'introduction de mutations pour donner naissance à Lui (incidence élevée de mâles) phénotype sont certaines des stratégies à travers lequel on peut enrichir la population masculine ^3.

Les mâles peuvent être facilement distingués des hermaphrodites en observant les ^quatre morphologie de la queue. La queue Hermaphrodite est souligné, tandis que la queue mâle est arrondi avec des structures d'accouplement.

Couper la queue des communiqués grand nombre de spermatides stockées à l'intérieur l'appareil reproducteur masculin. La dissection est réalisée sous un microscope stéréo en utilisant des aiguilles de calibre 27. Depuis spermatides ne sont pas physiquement connecté avec les autres cellules, la pression hydraulique expulse le contenu interne du corps masculin, y compris les spermatides ^2.

Les mâles sont directement disséqués sur une petite goutte de 'moyen du sperme ». Spermatides sont sensibles à l'altération du pH. Ainsi, HEPES, un composé avec une bonne capacité tampon est utilisé dans les médias du sperme. Le glucose et d'autres sels présents dans les médias du sperme aider à maintenir la pression osmotique pour maintenir l'intégrité des spermatozoïdes.

Post-méiotiques différenciation des spermatides en spermatozoïdes est appelée spermiogenèse ou l'activation des spermatozoïdes. Shakes ^{5, 6} et Nelson précédemment montré que les spermatides rondes peuvent être induites à se différencier en spermatozoïdes en ajoutant des composés activant diverses, y compris Pronase E. Ici nous démontrons in vitro de la spermiogenèse de C. spermatides elegans utilisant Pronase E.

Spermiogenèse réussie est pré-requis pour la fertilité et donc les mutants défectueux dans spermiogenèse sont stériles. Jusqu'alors plusieurs mutants ont été révélé défectueux spécifiquement dans ^sept processus de spermiogenèse. Anomalie trouvée lors de l'activation in vitro du roman de SPE (spermatogenèse défectueuse) mutants serait nous aider à découvrir d'autres joueurs participant à cet événement.

Protocole

1) L'enrichissement de la population masculine

1. Selon le besoin d'expérimentation, un grand nombre de mâles peut être obtenu en employant l'une des stratégies suivantes:
   1. grande population de mâles de type sauvage peut être obtenu par croisement 5 mâles de type sauvage et une hermaphrodite, sur une petite pelouse de l'OP50 ensemencé au centre de la plaque de NGM. Environ 50% de la génération suivante sera mâles de type sauvage.
   2. lui-5 (e1490) ou lui-8 (e1489) hermaphrodites jettent grand nombre de mâles. lui-5 et lui-huit mâles sont fertiles et il n'y a aucun défaut évident dans la morphologie des spermatozoïdes et de la fonction. Alors, lui-5-8 ou lui mâles peuvent être utilisés en lieu et place des hommes de type sauvage pour de nombreuses expériences.

2) Identification et isolement des hommes

1. Examinez la morphologie de la queue des vers; queue du ver mâle est arrondi.
2. Choisissez L4 mâles scène et de les transférer sur une plaque NGM ensemencé avec E. coli OP50 et les laisser pousser pendant une journée ou deux. Growing mâles célibataires en l'absence d'hermaphrodites prévenir la perte de sperme et donc grand nombre de spermatides seraient disponibles durant la procédure expérimentale.
3. Le jour de la dissection, le transfert des mâles célibataires sur une plaque de NGM sans bactéries et de les laisser ramper pendant quelques minutes. Cette étape permet d'enlever petite couche de E. coli adhère à la surface des vers. Alternativement, une pipette petit volume de tampon M9 (6g Na ₂ HPO _4, 3g KH ₂ PO _4, 5g de NaCl, 0,25 g MgSO ₄ .7 H ₂ O par litre) dans un verre de montre et les hommes de transfert dans la mémoire tampon.

3) La dissection des hommes et dans l'activation in vitro

1. Prenez une lame de verre et de marquer un petit cercle à l'aide d'un stylo pap. Pipeter 30 à 50 pl de milieu de sperme 1X (50 mM HEPES, 25 mM KCl, NaCl 45mm, 1 mM MgSO _4, 5 mM _de CaCl2, 10 mM de dextrose; pH 7,8) dans le cercle. Le cercle hydrophobe permet de conserver la moyenne du sperme dans ses limites.
2. Transférer les mâles 5-10 sur le milieu de sperme.
3. Voir la lame sous microscope, tenir deux seringues attaché avec 27 aiguilles de calibre sur vos deux mains.
4. Utilisez une aiguille à «tenir» le ver et utiliser l'autre aiguille pour couper l'extrémité postérieure des hommes pour libérer les spermatides.
5. Couper le ver expulse généralement très grand nombre de spermatides instantanément. Les spermatides sont visibles minute granulés »sous le microscope stéréo. Cependant, parfois, une partie ou la plupart des spermatides peuvent être conservés au sein de la carcasse. Dans ce cas, doucement "glisser" la carcasse sur la lame de verre peut faciliter la libération des spermatides de la carcasse.
6. Pour activer les spermatides, disséquer les vers dans un milieu de sperme 1X contenant E pronase (20μg/ml) et laissez-les reposer pendant 5 minutes.
7. Ne pas laisser les diapositives à devenir secs à aucun moment de l'expérience. Ajouter moyen sperme plus 1X si nécessaire.

4) Visualisation des spermtids et les spermatozoïdes

1. Placer délicatement une lamelle sur la surface de l'échantillon disséqué.
2. Trouver le domaine de spermatides sous faible grossissement (10X)
3. Détails fins de spermatides ou de spermatozoïdes peut être observée en se déplaçant à plus fort grossissement - habituellement à immersion dans l'huile 100X.

5) Les résultats représentatifs

Un exemple de l'image DIC des spermatides isolées de mâle C. elegans est montré dans la figure 1. Spermatides sont de forme sphérique et les noyaux sont importants. In vitro, les spermatozoïdes sont activés montre la figure 2.

Figure 1. DIC l'image de C. spermatides elegans.

Figure 2. Image de DIC in vitro C activée elegans spermatozoïdes.

Discussion

En plus d'analyser des mutants Spe, ce protocole a d'autres applications importantes, comme l'analyse la morphologie des spermatozoïdes avec le vieillissement. Spermatides et des spermatozoïdes isolés en utilisant ce protocole peut être utilisé dans d'autres expériences en aval tels que, immunomarquage de type sauvage et le sperme mutant ^{8, 9,} de la motilité du sperme sur des lames ^10, des mesures physiologiques ^{9, 11,} ou même l'insémination artificielle

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tuberculin syringe		Becton Dickinson	309623	Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in
Pap pen		Zymed	00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides		VWR International	16004-406	Dimension: 75X25X1mm
Cover glass		VWR International	48366045
Protease		Sigma	P-6911