L'utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

Résumé

Les protocoles pour l'utilisation ouverte biofilms débit du système avec des réacteurs à écoulement goutte à goutte et la rotation du disque réacteurs sont présentés en détail.

Résumé

La plupart des microbes dans la nature on pense qu'il existe en tant que surface associé les communautés dans les biofilms. ¹ biofilms bactériens sont encastrés dans une matrice et attaché à une surface. ² La formation du biofilm et de développement sont souvent étudiés en laboratoire en utilisant des systèmes discontinus tels que des plaques de microtitration ou de débit systèmes, tels que le flux de cellules. Ces méthodologies sont utiles pour le criblage de mutants et chimiques (plaques de microtitration) ³ ou en croissance des biofilms pour la visualisation (cellules d'écoulement) ^4. Nous présentons ici des protocoles détaillés pour Staphylococcus aureus croissante dans deux autres types de biofilms système de flux: le flux de réacteur à biofilm au goutte à goutte et le réacteur à disque tournant biofilm.

Réacteurs goutte de flux biofilm sont conçus pour l'étude des biofilms cultivés dans des conditions de faible cisaillement. ⁵ Le réacteur à flux goutte à goutte se compose de quatre canaux de test en parallèle, chacune capable de tenir un coupon standard de lame de verre de microscope entreprises, ou d'une longueur de cathéter ou relais. Le réacteur à flux goutte à goutte est idéal pour la surveillance de microcapteurs, des études générales biofilm, des échantillons de biofilm cryosectioning, forte production de biomasse, les évaluations du matériel médical et des tests de dispositifs médicaux à demeure. ^6,7,8,9

Le réacteur à disque tournant est constitué d'un disque en téflon contenant des évidements pour les coupons amovibles. ¹⁰ Les coupons amovible peut par fabriqués à partir de tout matériel usinable. Le fond de rotation du disque contient une barre aimantée pour permettre la rotation du disque à créer de cisaillement sur la surface de la surface du liquide, rincer coupons. La totalité du disque contenant 18 coupons est placée dans un récipient en verre 1000 ml réacteur bras latéral. Un milieu de croissance liquide est distribué à travers le vaisseau tandis que le disque est en rotation par un agitateur magnétique. Les coupons sont retirés de la cuve du réacteur et ensuite raclé pour prélever l'échantillon de biofilm pour la poursuite des études ou l'imagerie microscopique. Réacteurs disque rotatif sont conçus pour des évaluations en laboratoire de l'efficacité biocide, l'élimination du biofilm et la performance des matériaux anti-fouling. ^9,11,12,13

Protocole

1. Le réacteur à biofilm goutte débit

1. Le réacteur à biofilm au goutte à goutte de débit (disponible à partir des technologies Biosurface ou personnalisée des versions conçues peuvent généralement être faites par les ateliers d'usinage université, voir figure 1) est assemblé et autoclavés. Assemblée implique l'apposition des coupons dans les chambres et les couvercles de chambre de fixation. La chambre, avec support du biofilm (bouillon trypticase soja 2 grammes / L et la glycémie 2 grammes / L), et influent tube nutriments sont stérilisés par autoclavage.
2. L'inoculation du réacteur à écoulement goutte à goutte est préformé en plaçant le réacteur sur une surface plane, les lignes de serrage tube effluents, remplissant chaque chambre avec 10 ml de bouillon de soja tryptique et l'ajout de 10 uL d'un S. la culture aureus cultivées pendant une nuit dans du bouillon de trypticase soja. Le réacteur est ensuite inoculé dans un incubateur à 37 ° C pendant 18 heures.
3. Après 18 heures d'incubation, les tubes de l'effluent est desserré et le réacteur est placé sur un bloc de bois coupé à un angle de 10 °.
4. Aseptiquement raccorder le tuyau influents de nutriments dans la bouteille contenant le bouillon flux continu en nutriments. Flux de la ligne tube à travers la pompe et les tubes Premier en exécutant la pompe à une vitesse maximale (varie selon le modèle de pompe).
5. Une fois le tuyau influent est amorcée arrêter la pompe et attacher aiguilles connecter (calibre 22, 1 po) à l'extrémité de chaque tube. Essuyez le bouchon d'entrée de chambre avec un mélange éthanol essuyer et aseptiquement insérer les aiguilles à travers le bouchon d'entrée.
6. Tournez sur la pompe et permettre aux médias de goutte à goutte lentement (débit ~ 125 pi / min) sur les coupons. Les médias devraient flux descendant le long du coupon à partir du port d'entrée un bouchon sur le port des effluents. Fonctionner le réacteur en flux continu pendant 2-5 jours (selon l'application), parfois vérifier le réacteur pour un bon drainage.
7. Pour récolter les biofilms goutte à goutte de flux réacteur, arrêter la pompe et retirez soigneusement les aiguilles du réacteur. Le réacteur peut alors être placé sur une surface plane et les coupons peuvent être retirés de façon aseptique en utilisant des pinces stériles. Si la microscopie est souhaitée, les coupons peuvent désormais être traitées en conséquence (figure 2B est une micrographie électronique à balayage d'un biofilm de S. aureus cultivées dans un réacteur à biofilm goutte à goutte). Si la quantification de la biomasse ou d'études de physiologie du biofilm sont l'objectif de l'étude, le biofilm peut être retiré de le coupon à l'aide d'un grattoir cellulaire. Tout en maintenant les coupons avec une pince, grattez délicatement le biofilm hors coupon dans un tube conique contenant tampon phosphate salin à l'aide d'un grattoir cellulaire. Remarque: pour quantifier les unités formant colonie dans les biofilms, il est nécessaire d'homogénéiser les biofilms récoltées avec un tissu homogénéisateur de désagréger touffes et forment une suspension homogène. Différents modèles de homogénéisateurs tissus sont adaptés à cette application. Nous utilisons un Fisher Scientific Tissuemiser Homogénéisateur (produit # 15-338-420) à pleine vitesse pendant 1 minute pour homogénéiser les échantillons de biofilms. Le défaut d'homogénéiser le biofilm se traduira par une sous-estimation des unités formant colonie présents dans l'échantillon.

2. Le réacteur à disque rotatif biofilm

1. Le réacteur à disque tournant biofilm (disponible à partir de technologies disponibles Biosurface ou peut être fait sur mesure, voir figure 3) est assemblé et autoclavés. Assemblez le réacteur par la première place de la filature coupons le disque dans les fentes du disque tournant et en le plaçant dans un bécher de verre de 1 litre équipé d'un port de débordement. Un numéro de 15 bouchon en caoutchouc avec des trous percés dans ce pour permettre l'écoulement des médias et l'aération est utilisée comme le bouchon du réacteur. Le réacteur, le biofilm des médias (bouillon trypticase soja 2 g / L et la glycémie à 2 g / L), et les tubes d'entrée sont ensuite stérilisés par autoclavage.
2. Le réacteur à disque tournant biofilm est inoculé en plaçant 250 ml de milieu stérile dans le réacteur, et l'ajout de 0,5 mL d'une nuit S. la culture aureus cultivées en bouillon trypticase soja. Le réacteur est ensuite placé sur une plaque d'agitation réglée sur 250 rpm et incubée une nuit à la température désirée.
3. Après 16 heures d'incubation raccorder le tuyau d'entrée au port sur le réservoir moyen et le connecter à la pompe péristaltique. La pompe est ensuite activer et de flux mis à ~ 0,25 mL / min (débit peut être modifié en fonction du taux de croissance souhaité).
4. Après 24 heures d'arrêt du réacteur et aseptiquement retirer le disque sans toucher les coupons biofilm. Retirer les coupons en utilisant une pince stérile et trempette chacun en tampon phosphate salin pour éliminer toute bactérie lâchement.
5. Pour tester composé antimicrobien, les puces peuvent être placés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant des composés d'intérêt. Après incubation, les copeaux sont transférés dans des microtubes 1,5 ml contenant 1 ml de tampon phosphate salin et homogénéisé avec un tissu homogénéisateur pour disperser le biofilm intact.
6. Les cellules sont ensuite diluées en série et étalées sur milieu nutritif gélosé pour déterminer colonie viable Formiunités ng.
7. Remarque: de nombreuses variantes peuvent être faites sur le protocole ci-dessus. Par exemple, des coupons disque rotatif peut être enduit avec ou fabriqués à partir de potentiel anti-biofilm composés à tester l'efficacité. Dispersants biofilm peut également être évaluée incuber les coupons en composés dispersants et les bactéries quantifier fixé par rapport détaché.

3. Les résultats représentatifs

Un exemple de mise en place réacteur à flux goutte à goutte est affiché si la figure 1. Après trois jours de l'écoulement de grandes quantités d'un biofilm s'accumule sur la surface du coupon, la figure 2A. La biomasse totale varie selon les souches bactériennes et les conditions de croissance précis. Un microscope électronique à balayage d'un S. biofilm aureus cultivés dans le réacteur de flux goutte à goutte est montré dans la figure 2B.

Un réacteur à disque tournant est montré dans la figure 3A. Le protocole décrit peut être adapté aux exigences spécifiques de manière générale tout micro-organisme capable de former un biofilm. La figure 3B montre le disque en rotation avec 18 disques de plastique apposés. Ces biofilms disque cultivées sont particulièrement bien adaptés pour les tests antimicrobiens et produire des résultats hautement reproductible ^11.

Figure 1. La configuration de réacteur au goutte à goutte de flux. Les éléments importants sont étiquetés.

Figure 2. Exemple d'un écoulement goutte à goutte S. biofilm aureus. A) Ce biofilm a été cultivé pendant trois jours suivant le protocole décrit. Couvercles des deux premières chambres du réacteur sont enlevés pour montrer le jaune S. biomasse biofilm aureus. B) Sacnning Micrographie électronique d'un S. biofilm aureus cultivés dans le réacteur de flux goutte à goutte.

Figure 3. Le réacteur à disque tournant. A) Exemple d'un réacteur à disque rotatif en marche. Composante clé sont étiquetés. B) Gros plan sur un disque rotatif.

Discussion

Les biofilms cultivés dans différents réacteurs auront souvent des caractéristiques différentes et chaque réacteur a des applications différentes. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation de deux réacteurs à film biologique: un réacteur à biofilm au goutte à goutte de débit et d'un réacteur à disque tournant. Réacteurs à écoulement goutte à goutte sont utiles pour la croissance faible des biofilms de cisaillement à l'interface air-liquide et sont adaptables à une variété de condi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drip Flow Reactors	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
Rotating Disk Reactors	BioSurface Technologies Corporation