Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

Résumé

Imagerie par résonance magnétique (IRM) est devenue un outil de plus en plus populaire pour examiner le phénotype des souris génétiquement modifiées. Cet article illustre les méthodes nécessaires pour atteindre à haut débit phénotypage de souris génétiquement modifiées à l'aide de plusieurs souris IRM.

Résumé

Le domaine de phénotypage de souris avec l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est en croissance rapide, motivée par la nécessité d'améliorer les outils de caractérisation et d'évaluation des modèles murins de maladies humaines. L'IRM est une modalité excellent pour enquêter sur les animaux génétiquement modifiés. Il est capable de couverture ensemble du cerveau, peuvent être utilisés in vivo, et prévoit des mécanismes de contraste multiples pour étudier les différents aspects de neuranatomy et la physiologie. L'avènement des scanners haut champ avec la possibilité de numériser simultanément plusieurs souris permet de phénotypage rapide de nouvelles mutations.

Efficace de souris études IRM nécessitent une attention à de nombreux aspects de la conception de l'expérience. Dans cet article, nous allons décrire les méthodes générales d'acquérir des images de qualité pour le phénotypage de souris en utilisant un système que les souris des images simultanément en radio fréquence blindé émission / réception (RF) des bobines dans un aimant commun (Bock et al., 2003). Nous nous concentrons particulièrement sur le phénotypage anatomiques, une application importante et accessible qui a montré un potentiel élevé d'impact dans de nombreux modèles de souris dans notre centre d'imagerie. Avant que nous puissions fournir les étapes détaillées pour acquérir de telles images, il ya d'importantes considérations d'ordre pratique pour les deux in vivo l'imagerie cérébrale (Dazai et al., 2004) et ex vivo d'imagerie cérébrale (Printemps et al., 2007) qui devrait être noté. Ces questions sont abordées ci-dessous.

Protocole

1. Multiple-souris dans l'imagerie cérébrale in vivo:

Lorsque les animaux imagerie en temps réel, plusieurs caractéristiques clés doivent être présents pendant toute la session d'imagerie: 1) une méthode sûre de l'anesthésie, 2) le contrôle de l'environnement et 3) la surveillance physiologique. Par ailleurs, lorsque les sujets d'imagerie simultanée de plusieurs, il ya ajouté la complexité quant à la facilité et la rapidité de préparation et de la reproductibilité des positions des animaux pour faciliter l'enregistrement de l'image. En conséquence, trois grands composants personnalisés ont été conçus et fabriqués: un système de chargement pour insérer la souris en bobines RF au sein de l'IRM, une chambre d'induction pour faciliter la préparation et une plateforme avec une surveillance intégrée conduit à normaliser la position.

Le système de chargement:

Le système de chargement de la souris se compose de deux parties principales: 'array chargement »de la« souris ruche et l'. Fonction principale de la ruche la souris est d'en septième position Millipede bobines RF (Varian systèmes RMN, Palo Alto, CA) dans un réseau hexagonal à l'intérieur de l'aimant. Le tableau de chargement a été conçu pour recueillir et transporter plusieurs souris logées dans des tubes de 50 millilitres par centrifugation avec des trous forés à travers leurs conseils pour permettre l'entrée de gaz anesthésique. Après les souris sont anesthésiées et interfacé à l'équipement de surveillance dans une zone de préparation dans le voisinage de l'aimant, ils sont insérés dans les tubes à centrifuger modifié et monté sur le tableau de chargement. Après le montage, toutes les souris, le tableau de chargement est transporté et inséré dans l'aimant et positionné sur un système de rail. Le système de rail permet le tableau pour couple avec la ruche souris lorsque poussé vers le bas de l'alésage de l'aimant. Une fois pleinement inséré dans l'aimant, le quai de centrifugation des tubes sur le système de prestation au sein de l'anesthésie bobines RF. L'isoflurane mélangé à l'oxygène est fourni à la fin ruche souris pour l'échantillon dans un tube long de l'axe de chaque bobine individuelle. Ce mélange de gaz anesthésiant se jette dans les tubes d'hier, les souris et est recueilli par une unité active balayage attaché à l'arrière du tableau de chargement (figure 1).

La Chambre d'induction:

Depuis des temps d'imagerie peut prendre jusqu'à trois heures, en minimisant le temps de préparation des animaux est essentielle pour limiter l'exposition de la souris à l'anesthésie. Ainsi, nous avons développé une chambre d'induction sur mesure pour simplifier le processus de préparation (figure 2). La chambre de l'induction personnalisé crée un environnement unique pour l'induction et la manipulation de plusieurs souris. Construit à partir d'acrylique clair, les caractéristiques de chambre à induction à fermeture automatique en silicone ports de l'iris pour minimiser les fuites de l'anesthésie et permet à l'utilisateur d'accéder à l'environnement interne sans avoir besoin de gants spéciaux. Comparé à masque classique et de circuits pour une seule souris, la chambre de l'induction est assez grande pour accueillir jusqu'à vingt souris et permet la manipulation libre de la souris sans l'attachement des tubes encombrants et des masques. L'appareil est fourni avec un débit constant de gaz anesthésique qui est recueillie à l'aide d'un système passif de balayage. Résistances chauffantes sont utilisées pour chauffer le plancher de la chambre pour maintenir la température du corps de l'animal pendant la préparation.

Le traîneau:

Un des aspects les plus délicats et fastidieux de préparer des souris pour l'IRM sont l'application de électrocardiographe (ECG) des électrodes et des sondes de température rectale. En outre, beaucoup des électrodes conventionnelles, telles que le brassard et électrodes aiguilles, ont été trouvés à fausser la posture de l'animal qui rend difficile de normaliser le positionnement. Par conséquent, nous avons conçu une plate-forme de positionnement formulaire personnalisé équipée avec embarqué ECG, la respiration et des sondes de température appelé le «traîneau» (US Patent 7,146,936) (figure 3). Contraintes de mouvement à partir de bandes velcro ont été utilisés pour limiter le mouvement de la tête.

Multiples étapes de la souris dans l'imagerie du cerveau in vivo:

1. Toutes les recherches souris nécessite locale du CAC (Comité de protection des animaux), l'approbation du IACUC (Institutional Animal Care et le Comité d'utilisation) ou équivalent pour les procédures de manipulation de la souris.
2. Toutes les procédures telles que l'identification et la pesée des animaux doit être effectué sous une enceinte de sécurité biologique (ESB) et de l'unité d'IRM. Les animaux sont transférés dans un récipient en plastique autoclavables et transporté à la chambre de l'induction d'IRM.
3. Les souris sont anesthésiées dans une chambre d'induction préchauffée avec 4% d'isoflurane et 4 L / min d'oxygène. Les animaux sont anesthésiés totalement une fois qu'ils ne répondent pas à pincer patte. Fourrure de la poitrine est enlevée en utilisant un épilateur (NAIR) si nécessaire pour fournir un meilleur contact avec l'ECG et les dispositifs de surveillance de température qui ont été intégrés dans un traîneau personnalisés. Salve Eve (Tears Naturale PM) est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement, et environ 0,3 ml de solution saline est administré par voie sous cutanée pour maintenir l'hydratation.
4. Gd-DTPA-BMA (Omniscan) peutêtre utilisé si l'amélioration de contraste est souhaitée. Si Gd-DTPA est utilisé, il sera dilué dans (volume final 300uL) saline et administré en une dose unique de 1 mmol / kg avant la session MR via IP.
5. Les souris sont ensuite chargés dans des traîneaux individuels, immobilisé avec des sangles et de glisser dans la tête ouverte tube 50ml conique (figure 3). Jusqu'à 7 souris vivantes peuvent être numérisés en une seule fois. Une fois que tous les animaux sont chargés de la surveillance physiologique connecté, définissez le niveau de l'isoflurane dans l'aimant à 2% et le niveau d'oxygène à 8 L / min.
6. Les tubes coniques sont montés dans un système d'amarrage (figure 1) destinée à des souris de position uniforme dans chaque bobine RF positionnée au centre de l'aimant. Une fois chargé, l'isoflurane peut être réduite à 0.9 à 2%. ECG et la température sont contrôlés sur chaque animal tout au long de la numérisation. Les animaux sont gardés au chaud pendant le cours de l'analyse de l'air réchauffé.
7. La durée de chaque balayage en trois dimensions est d'environ 3 heures. Les détails sont les suivants: écho de spin rapide avec TR de 2300 ms et une TEeff de 36 ms. Echo longueur des trains de 8 avec une moyenne. Résolution de l'image résultante est de 125 um (figure 4).
8. Lorsque l'analyse est terminée, les animaux sont retirés de l'aimant et déchargés dans une chambre d'induction chaude remplie d'oxygène à 100%. Les animaux sont transférés dans un des récipients en plastique scellé et transporté dans un BSC. Ils sont placés sur une cage projet chaude gratuite et a permis de récupérer de l'anesthésie.

2. Multiple-Mouse Imaging ex vivo du cerveau:

Insensible aux artefacts de mouvement, fixe l'IRM réalise une résolution plus élevée que l'imagerie en direct. Haute résolution en trois dimensions des ensembles de données fournissent une flexibilité maximale à extraire des informations quantitatives et permettent une analyse automatique des images. Un large bobine RF personnalisée a été développé pour l'acquisition parallèle de 16 ensembles de données MR haute résolution de fixe-crâne dans les cerveaux de souris nuit séances de balayage.

Le 16-Coil ex vivo d'imagerie cérébrale Array:

Un tableau personnalisé construit électrovanne 16 bobine a été créé à l'image de 16 échantillons simultanément. Cette conception améliore un prototype antérieur utilisé à l'image de trois échantillons simultanément dans un ensemble de gradient insérez 60mm. Les bobines 8-tour sur la blessure aux extrémités pour fournir une sensibilité uniforme à moins de 10% sur une longueur de 26mm et sont blindés individuellement au sein de compartiments modulaires (Idziak et Haeberlen, 1982). Les 16 compartiments de la bobine sont assemblés sur un cadre (figure 5), ce qui positionne les bobines dans le dégradé et les colliers qu'elle en place en utilisant une vessie pneumatique afin de minimiser le mouvement.

Multiple-souris ex vivo les étapes d'imagerie cérébrale:

1. Cavité thoracique ouverte et insérez l'aiguille (ou de perfusion de sécurité ailé, 25G X 3 / 4) dans le ventricule gauche du cœur d'une souris anesthésiée (par injection intrapéritonéale de kétamine (150 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) . Couper l'oreillette droite.
2. Perfusion transcardiaque rincer avec 30 mL 1 temp X PBS + 1 pl / ml d'héparine (1000 unités USP / ml) ProHance + 2 mM à un débit d'environ 100 ml / hr.
3. Passent de fixation avec 30 ml de 4% PFA (température ambiante) ProHance + mm 2 à 100 ml / hr.
4. Décapiter et enlever la peau, la mâchoire inférieure, les oreilles, bout du nez cartilagineux.
5. Placez la structure du crâne reste dans PFA 4% + 2 mM ProHance nuit à 4 ° C.
6. Transfert à PBS 1X + azide de sodium à 0,02% ProHance + mm 2.
7. Haute résolution trois dimensions de balayage IRM à 7 Tesla se produit entre 4 jours et pas plus de 2,5 mois après la perfusion. Les cerveaux sont placés dans un tableau de 16 canaux, électrovanne bobine (figure 5).
8. Paramètres d'imagerie sont comme suit: écho de spin rapide avec TR 325 ms et une TEeff de 30 ms, la longueur des trains écho de 6 à 4 en moyenne. Les images finales ont une résolution isotropique de 32 um (figure 6) et la durée de balayage est d'environ 12 heures.
9. Après la numérisation, placez le crâne dans formol à 10% + 2 mM ProHance pour la conservation.

3. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Le système de chargement de la souris. Le "tableau de chargement" et "souris ruche" relié à un système de rails en fibre de verre commun.

Figure 2. La chambre de l'induction.

Figure 3. A) Le traîneau, montrant des capteurs de surveillance embarqués et appuie-tête. b) Une souris anesthésiés sur un traîneau avec l'appuie-tête ci-joint. L'assemblage de traîneau glisse facilement dans le tube à centrifuger.

Figure 4. in vivo des images multiples du cerveau d'un scanner 3 heures trois dimensions.

Figure 5. 16-canaux large bobine pour la numérisation de 16 échantillons de cerveau fixe.

Figure 6. Représentant l'image du cerveau ex-vivo.

Discussion

Tant l'in vivo et ex vivo chez la souris l'image des systèmes d'imagerie sujets multiples à la fois pour augmenter le débit des études d'imagerie considérablement sans augmenter le temps d'imagerie. Les images du cerveau à la fois de l'in vivo et ex vivo des techniques d'imagerie multi-souris sont de haute qualité et sont adaptés pour le phénotypage des structures majeures et mineures dans le cerveau de souris respectivement.

Afin de minimiser le temps de préparation des spécimens d'animaux multiples, la parallélisation des processus est d'une importance capitale. Par exemple, le développement de la chambre d'induction a permis à l'induction de spécimens multiples simultanément, et le traîneau a synchronisé l'application de l'ECG et les sondes de température tout en standardisant le positionnement du corps. En outre, notre système d'imagerie ex vivo nous permet d'acquérir une haute résolution des images tridimensionnelles de 16 fixes cerveaux entiers en une seule fois ce qui est idéal pour les études de phénotypage à haut débit.

Les limitations possibles de notre système d'imagerie in vivo comprennent l'incapacité de contrôler individuellement anesthésique et de température pour chaque souris. Si nécessaire un contrôle individuel anesthésie peut être mis en œuvre avec l'ajout d'exclusivité évaporateurs d'anesthésie pour chaque souris. Une autre limitation de l'imagerie in vivo du système est que la numérisation est limitée à des souris qui sont inférieures d'environ 32 grammes. Cependant, il existe un plan actuellement pour augmenter la taille bobine à accueillir de plus grands animaux.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)		Baxter	CA2L9108
NAIR		Church & Dwight Canada Corp.
Tears Naturale P.M.		Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)		GE healthcare	J-110A
Custom Sleds		Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg		Wisent	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml		Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)		Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)		Sigma	P-6148-500g
Sodium Azide		Fisher	S227-100
Formalin 10%		Fisher	SF100-4