Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

Résumé

Une méthode pour la photo-encapsulation de cellules dans un hydrogel PEG réticulé est décrite. De signalisation hypoxique dans les insulinome murin encapsulé (min6) agrégats sont suivis en utilisant un système de marqueur fluorescent. Ce système permet l'examen en série de cellules dans un hydrogel et d'échafaudage de corrélation de la signalisation hypoxique avec des changements dans le phénotype cellulaire.

Résumé

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Protocole

1. La synthèse et de PEGDM PEGDM photoactifs solution de macromère préparation

1. Peser 2 g de PEG (linéaire, 10.000 Da) dans un flacon en verre de 40 mL avec un bouchon en plastique dur.
2. Ajouter environ 308μL d'anhydride méthacrylique et lâchement bouchon du flacon.
3. Micro-ondes le flacon à température élevée pendant 2 minutes au micro-ondes domestique standard. Des gants résistant à la chaleur port, soigneusement vortex le flacon, puis micro-ondes à puissance maximale pendant 5 minutes supplémentaires.
4. Brièvement attendre que le flacon assez cool pour être manipulés avec des gants. Déboucher et c'est ajouter lentement le chlorure de méthylène tout tourbillonnant dans le flacon. Ajouter suffisamment pour que la solution semble claire et homogène, vortex de l'échantillon nécessaire. Le volume total de chlorure de méthylène utilisé doit être de 1,5 - 2 ml.
5. PEGDM précipité dans 200 ml de froid, on a agité l'éther diéthylique en ajoutant goutte à goutte une solution.
6. Recueillir les PEGDM par filtration sous vide et de lui permettre de sécher.
7. Dissoudre le PEGDM en quantité suffisanted'eau déminéralisée (typiquement 100 -150 ml).
8. Dialyser la solution contre l'eau désionisée pendant 5 jours dans un tube à dialyse avec un poids moléculaire de coupure de 1000 Da. Remplacer l'eau une fois par jour.
9. Aliquoter la solution dans des conteneurs appropriés et congeler à -80 ° C pendant la nuit. Lyophiliser la solution pendant 4 jours pour donner une poudre blanche purifiée PEGDM. Conserver la poudre à 4 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé.
10. Pour préparer une solution PEGDM photoactifs, d'abord préparer un stock de 0,5 pour cent en poids photoinitiateur solution en dissolvant Irgacure 2959 dans l'eau déminéralisée. Vortex de la solution et la stocker dans l'obscurité.
11. Préparer un PEGDM 10% en poids et 0,025% en poids Irgacure 2959 solution dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Vortex à fond pour assurer la dissolution de l'PEGDM. Nous préparent habituellement 1 mL de cette solution à la fois.
12. Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de 0,2 um seringue dans un tube de 1,8 ml microtubes. Envelopper le tube dans du papier d'aluminiumet conserver à 4 ° C

2. Culture, l'infection, et l'agrégation des cellules min6

1. Min6 cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS, le glucose 7mm, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 0,5 pg / mL amphotercin B dans un environnement humide à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Pour libérer les cellules de la surface de flacon de culture traitée, aspirer le support, rincer les cellules avec 37 ° C de calcium / magnésium sans HBSS, aspirer le HBSS, puis ajoutez 2 ml de 37 ° C la trypsine-EDTA solution et permettre aux cellules de incuber pendant 3 minutes.
3. Fermement jar le côté du flacon pour frapper les cellules libres, puis ajoutez 8 ml de 37 ° C moyenne et vigoureusement la pipette de la suspension cellulaire de haut en bas en prenant soin de ne pas introduire de bulles.
4. Pipeter les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et effectuer un comptage des cellules en utilisant un hématimètre ou autre cellule procédure de comptage.
5. En se préparant à infecter les cellules avec le fabricantvirus, d'abord déterminer le nombre total de cellules d'être infectées et de calculer le volume de suspension de virus nécessaire pour atteindre la multiplicité désirée d'infection (MOI) (50 à 100 particules infectieuses par cellule).
6. Diluer le virus dans HBSS en prenant soin de pipetage la quantité appropriée de suspension du virus dans un volume pré-aliquotés de HBSS dans un tube 1,8 ml microtubes. 50 ul de HBSS par puits de cellules agrégation est approprié.
7. Disperser les cellules en les pipetage de haut en bas dans leur tube, puis pipeter le volume nécessaire pour atteindre 400 000 cellules par puits dans les puits d'une plaque à 6 puits culture en suspension.
8. Ajouter le volume approprié de virus dilué dans chaque puits pour atteindre les résultats souhaités MOI.
9. Ajouter à moyen et à chaque puits pour amener le volume total jusqu'à 1,7 ml.
10. Placer la plaque sur un agitateur orbital à l'intérieur de l'incubateur. Régler le vibreur sur un réglage bas pour que le milieu se lave en douceur autour du puits (~ 100 rpm). Laisser les cellules agrégationTE pendant 24-36 heures. Granulats avec un diamètre approximatif de 75 à 175 um devrait être formé.

3. L'encapsulation des cellules dans PEGDM

1. Les cellules peuvent être encapsulées sous forme de dispersion (étape 2.4) ou l'agrégation suivante (étape 2.10). Comme la solution PEGDM hydrogel précurseur est un liquide, les cellules peuvent avoir tendance à régler avant de réticulation et la formation d'hydrogel. Si le règlement est prévu pour se produire rapidement, comme avec de plus grands agrégats, il peut être avantageux de produire de l'hydrogel en deux étapes afin que les cellules se déposent un plan central du gel. Une procédure en une seule étape la synthèse d'hydrogel appropriés pour les cellules dispersées est montré (figure 2) et la procédure en deux étapes est ainsi montré (figure 3) et détaillée ci-dessous (3.2 à 3.9).
2. Créer un récipient dans lequel l'hydrogel sera formé en coupant la pointe conique hors d'une seringue de 1 ml en plastique et en plaçant l'ouvrir jusqu'à la fin dans un rack.
3. Pipeter 20 ul de PEGDM photoactifs afinlution dans l'extrémité ouverte de la seringue sur le piston en s'assurant que le volume couvre la surface entière plongeur. Régler le piston en petits incréments pour obtenir une surface plane du liquide.
4. Placez la pipette dans le rack et la position de la grille en dessous d'une lampe UV (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ pendant environ 8 minutes pour permettre à la réticulation hydrogel. Pendant ce temps, la préparation des cellules peut être commencé
5. Pipet un volume contenant le nombre désiré de cellules / agrégats dans un tube de 1,8 ml microtubes, capuchon et centrifuger le tube à 130 g pendant 5 minutes.
6. Utiliser une micropipette, retirer soigneusement les médias sans déranger le culot cellulaire à l'extrémité du tube. A la tête des médias des approches du culot, il peut être utile d'utiliser une plus fine, 10 uL pipette.
7. Doucement resuspendre le culot cellulaire dans 20 uL de solution PEGDM photoactifs (utiliser une pipette à large ouverture si l'on travaille avec des granulats) et ajouter la suspension cellulaire à la seringue sur le dessus de ee préalablement réticulé portion d'hydrogel.
8. Exposer la seringue pour un 8 minutes supplémentaires de la lumière UV pour terminer la construction de l'hydrogel. Lorsque vous avez terminé, les cellules doivent être entièrement encapsulés au sein de l'hydrogel cylindriques (figure 3).
9. Ejecter l'hydrogel de la seringue et dans 1 ml de HBSS dans le puits d'une plaque de 24 puits brièvement laver le gel. Transférer le gel à 1 mL de médias dans le puits d'une plaque de 24 puits et la culture dans les conditions souhaitées.

4. Suivi hypoxie

1. A tout moment pendant la culture, l'image des cellules par microscopie fluorescente pour suivre l'initiation de la signalisation hypoxique. Selon ce qui est imagé, vous pouvez créer une image de la plaque multi-puits ou de transférer le gel sur une lame de microscope avant de le placer sur la platine du microscope. Pic de l'excitation Ds Rouge est atteint à 556nm et de pic d'émission se produit à 586nm. L'émission est assez intense et donc photoblanchiment n'a pas été obed pour être problématique. Délai entre l'initiation de la production de protéines et de détection premier signal est d'environ 12 heures. Le signal est suffisamment précis pour identifier individuellement les cellules de signalisation, mais la résolution risque d'être insuffisante pour déterminer la localisation du signal intracellulaire. Dans les cellules de signalisation, le signal est généralement observée uniformément dans le cytoplasme. L'intensité du signal peut également augmenter l'exposition prolongée à l'hypoxie, mais nous n'avons pas encore totalement déterminé si cela est dû à l'expression accrue des protéines, l'accumulation de protéines dans l'ensemble, ou la maturation des protéines retardée.

5. Les résultats représentatifs

Un exemple représentatif de min6 agrégats encapsulé dans un hydrogel PEG est montré dans la figure 4. Le gel réticulé sera solide tout au long, prenant la forme du récipient dans lequel la réaction a été effectuée. Un gel aux surfaces lisses et externe est préférable pour l'implantation d'une aide dans la prévention d'un nouveau corps étrangersponse. L'intérieur du gel, des agrégats de cellules doivent être entièrement fermés dans la matrice et distribuée de façon homogène pour permettre le transport des nutriments mieux.

Des images représentatives de la signalisation hypoxique dans les min6 agrégats sont représentés dans la figure 5. Identique min6 agrégats infectées par le virus de marqueur ont été cultivées en soit 20% d'O ₂ (5a) ou 1% d'O ₂ (5b) pour 44 heures avant la capture d'image.

Figure 1. Schéma de l'activité de notre système de marqueur de l'hypoxie. L'insertion du gène adénoviraux Ds Rouge RD et en amont permet de HRE promoteur induite par l'hypoxie production de la protéine fluorescente sous contrôle de HIF-1.

Figure 2. Diagramme de procédure pour l'encapsulation en une seule étape de la dispersion min6 cellules dans un crosslinked hydrogel PEGDM. Pour chaque gel, les cellules dispersées sont en suspension dans 40μL de la solution de macromère photoactifs PEGDM. Il est placé dans une seringue de 1 ml décapitée et l'hydrogel est formé sous la lumière UV 365nm après 10-12 minutes. Une fois terminée, le disque d'hydrogel est retiré de la seringue, lavés et placés dans une assiette bien remplie moyen pour l'incubation.

Figure 3. Diagramme de procédure pour l'encapsulation double étape de agrégées min6 cellules dans un hydrogel réticulé PEGDM. Pour chaque gel, une demi-gel est d'abord formée par réticulation UV de 20 pi de la solution de macromère photoactifs PEGDM pendant 8 minutes. Min6 agrégats sont soigneusement en suspension dans une solution de 20 pi supplémentaires de macromère photoactifs qui est ajouté au sommet de la pré-formé demi-gel. Le gel complet est formé par un 8 minutes supplémentaires d'exposition aux rayons UV avec des granulats entièrement encapsulé dans la médialeplan du gel.

Figure 4. Image d'un hydrogel 40μL sous un grossissement de 20x. Min6 agrégats (~ 400 000 cellules au total) sont clairement visibles dans le gel. Diamètre est d'environ 6mm d'hydrogel (barre = 1 mm).

Hypoxie Figure 5. Fluorescents de signalisation dans les cellules agrégées min6 dans un hydrogel PEGDM. Les cellules qui ont été encapsulées et ensuite mis en incubation à 20% d'O ₂ pendant 44 heures ne s'affichent pas de signalisation hypoxie (a) tandis que les cellules qui ont été encapsulées puis incubés dans _2% O 2 pour 44 heures d'affichage signal clair et omniprésent. (Barre = 100 microns) (b).

Discussion

La méthode présentée ici propose une technique simple et rapide pour l'encapsulation de cellules dans un hydrogel PEG avec une utilisation minimale des conditions non physiologiques. PEG constitue un matériau d'encapsulation très utile pour sa biocompatibilité et la facilité de modification. Simple variation du pourcentage de PEG dans la solution photoactifs, par exemple, peut être utilisé pour ajuster les propriétés mécaniques, telles que le module de compression et les propriétés de transport grâce à la taille des pores. En outre, le PEG est facilement modifiée par l'ajout de chaînes latérales. Hydrogels PEG, par conséquent, représentent à la fois un dispositif clinique prometteur et une plateforme flexible pour la recherche in vitro

Une méthode pour le suivi de l'hypoxie dans le PEG-encapsulé cellules a également été présenté. Cette méthode est utile pour la simplicité de la détection d'hypoxie et d'éviter la nécessité de sacrifier les cellules d'intérêt. La technique peut être appliquée à une variété de types de cellules dans une variété de conditions rendant son-nousefulness large. Par exemple, l'hypoxie comme un indice de différenciation de cellules souches peuvent être suivis dans les cultures de cellules souches micromasse. Cependant, cette méthode ne peut être appliquée aux systèmes dispersés de cellules ou d'un système dans lequel les cellules sont dispersées tard agrégées. En outre, la détection du signal fluorescent peut être difficile dans les tissus plus ou dense.

matériels

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Anhydride méthacrylique	Sigma-Aldrich	276 685-100ml
Micro-ondes	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Chlorure de méthylène	Sigma-Aldrich	D65100-1L
L'éther diéthylique	Sigma-Aldrich	346136-1L
Tubes de dialyse	Spectrum	132640
	Laboratoires
Congélateur
Lyophilisateur	Labconco	7670521
Pompe à vide	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21 à 022-CV
Filtre seringue	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* La formulation personnalisée
FBS	Laboratoires AAP	A15-351
Pénicilline-streptomycine	Mediatech	30 à 002-CI
L'amphotéricine B	Mediatech	30 à 003-CF
Incubateur	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w / O2 de suppression
Trypsine EDTA	Mediatech	25 à 052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
Lampe UV	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Contient deux 40W, 365nm ampoules blacklight UV bleue
Centrifugeuse	Eppendorf	5811 000.010 *	* Numéro de commande. Modèle 5810 R
Microscope	Nikon	TI-ND6-PFS	Avec filterset pour l'excitation 556nm / 586nm d'émission